امتصاص / تأين الليزر بمساعدة المصفوفة المضان مع قياس الطيف الكتلي للتأين الناجم عن الليزر للخلايا العصبية الفردية للفئران
مايو 23, 2025
يحدد هذا البروتوكول استخدام microMS لقياس الطيف الكتلي MALDI-2 أحادي الخلية الموجه بالفلورة ، مما يتيح التنميط الجزيئي المعزز للخلايا العصبية الأولية للفئران.
يركز بحثنا على تطوير تدفقات عمل قياس الطيف الكتلي MALDI عالية الإنتاجية وموجهة بالصور وحيدة الخلية للكشف عن عدم التجانس الخلوي وربط الملامح الجزيئية بهوية الخلية ووظيفتها واستجابتها في الأنظمة المعقدة.
تتيح الأجهزة المتقدمة ، مثل MALDI-2 ومطياف الكتلة عالي الدقة المكانية ، التحليل المستهدف والمحلي للخلايا المفردة ، مما يعزز الحساسية ويوسع نطاق التنميط الجزيئي في الأنسجة المعقدة. تشمل التحديات الحالية الحساسية المحدودة وقابلية التكرار عبر العينات وتحليل البيانات المعقدة. غالبا ما تكون بيانات MALDI متناثرة ومجموعات بيانات كبيرة بها آلاف الخلايا ومئات الجزيئات تتطلب أدوات حسابية قوية.
يعالج هذا البروتوكول الفجوة في الأساليب عالية الإنتاجية لتحليل الخلايا الفردية وحتى العضيات ، مما يتيح إجراء دراسات مفصلة للغاية عن عدم التجانس واكتساب رؤى حول البيولوجيا والوظيفة الجزيئية والخلوية.
يسمح هذا البروتوكول بالتحليل السريع المستهدف للخلايا المنتشرة عبر الشريحة، مما يلغي الحاجة إلى معالجة الخلايا أو مسح المنطقة الكاملة وزيادة الإنتاجية بشكل كبير.
[الراوي] للبدء ، اشطف كل شريحة بملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من أسيتات الأمونيوم 150 ملليمولار لإزالة بلورات الجلسرين والملح التي يمكن أن تتداخل مع الفحص المجهري وتطبيق مصفوفة MALDI ، ثم جفف الشرائح تحت تيار لطيف من النيتروجين أو اتركها تجف تماما في الهواء. قم بتحميل الشريحة المجففة في مرحلة المجهر. قم بتركيز المجهر باستخدام 10 نقاط دعم على الأقل موزعة بالتساوي عبر الشريحة بأكملها. باستخدام مرشحات مناسبة ل DAPI والتصوير بالمجال الساطع ، احصل على صورة مضان مبلطة للشريحة بأكملها بتكبير 5x إلى 10x ، مما يضمن التقاط العلامات الائتمانية على شرائح الفحص المجهري بوضوح في الصورة. قم بتجميع الصور المبلطة باستخدام برنامج الفحص المجهري ، مثل ZEN ZEISS. تحقق من عدم إزاحة الإطارات المتجانبة المتجاورة رأسيا. قم بمعالجة وتصدير كل صورة مخيطة كملف BigTIFF باستخدام برنامج الفحص المجهري أو كملف TIFF قياسي إذا كان حجم الصورة النهائي أقل من غيغابايت. قم بإذابة 20 ملليغرام من 2,5-ثنائي هيدروكسي أسيتوفينون في 1.5 مل من الأسيتون. ضع الشرائح في حامل غرفة التسامي ، ثم ضع الحامل في جهاز التسامي. قم بوضع محلول المصفوفة المذاب على رقاقة السيراميك واسمح للأسيتون بالتبخر تماما ، ثم أغلق غرفة التسامي لإغلاقها. املأ غرفة التبريد بطين من الماء المثلج وضعها بإحكام فوق غرفة التسامي. قم بتشغيل مضخة التفريغ والسماح للنظام بالتوازن لمدة خمس دقائق. ابدأ التسامي بتسخين الغرفة إلى 200 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة حمام الماء المثلج من الغرفة. اقلب درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية وضع المشتت الحراري فوق الغرفة. قم بالتنفيس ببطء عن غرفة التسامي لتحرير الضغط. افتح الغرفة وقم بإزالة الشرائح بعناية. افتح MicroMS وقم بإزالة صور الفحص المجهري BigTIFF باستخدام خيار مجموعة الصور لاستيعاب كل من قنوات المجال الساطع والفلورة. انتقل إلى أداة خيارات الكائن الثنائي كبير الحجم واضبط الحد الأقصى والحد الأدنى لحجم الكائن الثنائي كبير الحجم لتحديد نطاق حجم الكائن الثنائي كبير الحجم المقبول. قم بتعيين عتبة قناة التألق لاكتشاف الكائن الثنائي كبير الحجم. حدد قيمة التدوير لتحديد مدى الدائرية التي يجب أن تكون الخلايا المحددة للنظر فيها ، واختر اللون. استخدم خيار البحث عن الكائن الثنائي كبير الحجم للكشف عن الكائنات الثنائية كبيرة الحجم. عند المطالبة، احفظ قائمة الكائن الثنائي كبير الحجم تحت الاسم المطلوب. استخدم أداة Distance Filter لتعيين الحد الأدنى للمسافة بين كل خلية. اختبر الخطأ عبر نقاط الاختبار لتحديد خطأ الإزاحة بدقة. قم بتحميل الشرائح في الجهاز باستخدام محول الشريحة MTP II. بعد العودة إلى الكمبيوتر باستخدام MicroMS ، قم بالوصول إلى كمبيوتر مطياف الكتلة عبر تطبيق سطح المكتب البعيد. إذا كنت تستخدم الأداة لأول مرة، فتحقق من موضعها بالانتقال إلى الأدوات، متبوعا بإعدادات الأداة. في النافذة المنبثقة، اعرض مجموعة الإحداثيات مع موضعيها X وY وحدد كل نقطة من هذه النقاط المحددة في هندسة محول الشرائح II. قم بتحديث مواضع X و Y في نافذة MicroMS. باستخدام كاميرا مقياس الطيف الكتلي وعناصر التحكم في المسرح ، انتقل إلى موقع يمكن التعرف عليه بسهولة على الشريحة وانسخ إحداثيات الأداة. في MicroMS ، حدد نفس الموضع في صورة المجهر ، وانقر بزر الماوس الأيمن ، وأدخل الإحداثيات في النافذة المنبثقة. قم بتقريب الإحداثيات إلى أقرب الأعداد الصحيحة وافصلها بمسافة. بعد إضافة ثلاث نقاط تسجيل ، ستتحول إحدى الدوائر إلى اللون الأحمر ، مما يشير إلى أنها الموضع الأكثر انبعادا من التسجيل. احذف نقطة التسجيل باستخدام Control + انقر بزر الماوس الأيمن وحاول مرة أخرى. ضمن ملف، انتقل إلى حفظ ثم التسجيل لحفظ ملف التسجيل. مع ظهور الكائنات الثنائية كبيرة الحجم على الشريحة، انتقل إلى ملف وحفظ ثم مواضع الأداة لحفظ ملف موضع الأداة، ثم باستخدام برنامج سطح المكتب البعيد، انقل هذا الملف إلى كمبيوتر الأجهزة. افتح ملف XEO المخصص وانسخ محتوياته إلى محول شرائح MTP II . XEO على كمبيوتر الجهاز. احفظ الملف لتحديث هذا الملف الهندسي بمواقع الخلايا. انقر فوق علامة التبويب التنفيذ التلقائي وحدد جديد لإنشاء تشغيل تلقائي جديد. اسحب عبر منطقة العينة المعروضة لتحديد الخلايا وانقر بزر الماوس الأيمن لإضافتها إلى قائمة التحليل. احفظ التشغيل التلقائي وانقر فوق بدء التشغيل التلقائي لبدء الاستحواذ. يوضح هذا الشكل كيف يكشف توصيف قياس الطيف الكتلي MALDI-2 أحادي الخلية عن عدم التجانس الخلوي القائم على الدهون عبر وداخل مناطق الدماغ المتميزة. تقريب وإسقاط متشعب موحد ، أو تحليل UMAP ، يفصل الخلايا حسب منطقة الدماغ ، ويشكل مجموعات مميزة للمخطط والحصين والقشرة. كشفت تجميع لايدن عن أربع مجموعات سكانية فرعية للخلايا القائمة على الدهون. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت توقيعات دهنية خاصة بالكتلة ، مع ملامح كثافة مميزة عبر الدهون المشروحة. أظهرت الأطياف الكتلية من ست خلايا قشرية أيضا اكتشافا ثابتا للدهون عبر الشرائح. علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا القشرية من شرائح مختلفة توزيعات UMAP متداخلة ، مما يشير إلى الحد الأدنى من تأثيرات الدفعات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لاستخدام microMS لقياس الطيف الكتلي MALDI-2 الموجه بالفلورسنت، لتحليل خلية واحدة، مما يعزز التعريف الجزيئي لخلايا العصبون الرئيسية للفئران. تهدف الدراسة إلى معالجة التغاير الخلوي وربط الأنماط الجزيئية بالهوية والخاصية الخلوية في الأنسجة المعقدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- قياس الطيف الكتلي
- علم الأحياء الخلوية
الخلفية
- تسهل سير العمل الموجه بالصورة عالية الإنتاجية دراسات التغاير الخلوي.
- تسمح قياس الطيف الكتلي MALDI-2 المتقدمة بالتحليل المحلّل مكانيًا.
- تشمل التحديات الحالية مشكلات تحليل البيانات والحساسية.
- تعتبر الأدوات الحسابية القوية ضرورية لمجموعات البيانات الكبيرة.
غرض الدراسة
- لتحسين أساليب الإنتاج العالي لتحليل الخلايا الفردية.
- لربط البيانات الجزيئية بالهوية والخاصية الخلوية.
- لتعزيز الرؤى حول بيولوجيا الأنظمة العصبية المعقدة.
الأساليب المستخدمة
- يستخدم البروتوكول قياس الطيف الكتلي MALDI-2 لخلية واحدة للتحليل.
- يتكون النموذج الأساسي من خلايا العصبون الرئيسية للفئران.
- تشمل الخطوات إعداد الشريحة، وهجرة المصفوفة، وتحليل النقاط للكشف عن الخلايا.
- اكتساب صورة مجهرية مفصلة وتسجيل حسابي هما أمران حاسمان.
- يتضمن معالجة البيانات برمجيات مخصصة لتعزيز نتائج قياس الطيف الكتلي.
النتائج الرئيسية
- كشفت عن تغاير خلوي قائم على الدهون عبر مناطق الدماغ.
- نجحت تحليل UMAP في تجميع الخلايا حسب منطقة الدماغ.
- تم تحديد توقيعات دهون خاصة بالعنقود، مما سلط الضوء على الملفات الشخصية الخلوية المميزة.
الاستنتاجات
- يمكن هذا البروتوكول من التحليل السريع والمستهدف لخلايا العصبون دون تلاعب موسع.
- تعزز النتائج فهم البيولوجيا الجزيئية والخلوية في علم الأعصاب.
- يمكن أن تفيد الرؤى المكتسبة الدراسات المستقبلية حول الخاصية الخلوية في الأنسجة المعقدة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-throughput, fluorescence-guided MALDI-2 mass spectrometry enables precise molecular profiling of individual neural cells, addressing the challenge of cellular heterogeneity in complex tissues. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular signatures to cell identity and function. The approach supports portfolio decisions by providing scalable, reproducible single-cell data critical for target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular heterogeneity and molecular pathway mapping at single-cell resolution.
- Supports functional target validation by correlating molecular profiles with cell identity and region-specific biology.
- Facilitates predictive confidence in target selection through robust, high-content molecular data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible molecular outputs suitable for assay standardization.
- Reduces data size and increases throughput by targeting only cell locations, optimizing screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neural systems for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-slide and cross-region reproducibility.
- Provides mechanistic de-risking through detailed lipid-based cellular subpopulation analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and translational research in neuroscience and related fields.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neural cell diversity and molecular function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in single-cell contexts.
- Analytics: Delivers high-content, spatially resolved molecular measurements for robust comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with minimal batch effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for single-cell molecular profiling across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes high-throughput, reproducible single-cell analysis with reduced data burden.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, cross-sample molecular data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced mass spectrometry and fluorescence microscopy.
- Demands access to MALDI-2 instrumentation and computational infrastructure for data analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for image registration and data processing.
- Adaptable to various neural and potentially non-neural cell systems with appropriate validation.
- Data analysis complexity and reproducibility across samples are critical practical considerations.
