امتصاص / تأين الليزر بمساعدة المصفوفة المضان مع قياس الطيف الكتلي للتأين الناجم عن الليزر للخلايا العصبية الفردية للفئران

يركز بحثنا على تطوير تدفقات عمل قياس الطيف الكتلي MALDI عالية الإنتاجية وموجهة بالصور وحيدة الخلية للكشف عن عدم التجانس الخلوي وربط الملامح الجزيئية بهوية الخلية ووظيفتها واستجابتها في الأنظمة المعقدة.

تتيح الأجهزة المتقدمة ، مثل MALDI-2 ومطياف الكتلة عالي الدقة المكانية ، التحليل المستهدف والمحلي للخلايا المفردة ، مما يعزز الحساسية ويوسع نطاق التنميط الجزيئي في الأنسجة المعقدة. تشمل التحديات الحالية الحساسية المحدودة وقابلية التكرار عبر العينات وتحليل البيانات المعقدة. غالبا ما تكون بيانات MALDI متناثرة ومجموعات بيانات كبيرة بها آلاف الخلايا ومئات الجزيئات تتطلب أدوات حسابية قوية.

يعالج هذا البروتوكول الفجوة في الأساليب عالية الإنتاجية لتحليل الخلايا الفردية وحتى العضيات ، مما يتيح إجراء دراسات مفصلة للغاية عن عدم التجانس واكتساب رؤى حول البيولوجيا والوظيفة الجزيئية والخلوية.

يسمح هذا البروتوكول بالتحليل السريع المستهدف للخلايا المنتشرة عبر الشريحة، مما يلغي الحاجة إلى معالجة الخلايا أو مسح المنطقة الكاملة وزيادة الإنتاجية بشكل كبير.

[الراوي] للبدء ، اشطف كل شريحة بملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من أسيتات الأمونيوم 150 ملليمولار لإزالة بلورات الجلسرين والملح التي يمكن أن تتداخل مع الفحص المجهري وتطبيق مصفوفة MALDI ، ثم جفف الشرائح تحت تيار لطيف من النيتروجين أو اتركها تجف تماما في الهواء. قم بتحميل الشريحة المجففة في مرحلة المجهر. قم بتركيز المجهر باستخدام 10 نقاط دعم على الأقل موزعة بالتساوي عبر الشريحة بأكملها. باستخدام مرشحات مناسبة ل DAPI والتصوير بالمجال الساطع ، احصل على صورة مضان مبلطة للشريحة بأكملها بتكبير 5x إلى 10x ، مما يضمن التقاط العلامات الائتمانية على شرائح الفحص المجهري بوضوح في الصورة. قم بتجميع الصور المبلطة باستخدام برنامج الفحص المجهري ، مثل ZEN ZEISS. تحقق من عدم إزاحة الإطارات المتجانبة المتجاورة رأسيا. قم بمعالجة وتصدير كل صورة مخيطة كملف BigTIFF باستخدام برنامج الفحص المجهري أو كملف TIFF قياسي إذا كان حجم الصورة النهائي أقل من غيغابايت. قم بإذابة 20 ملليغرام من 2,5-ثنائي هيدروكسي أسيتوفينون في 1.5 مل من الأسيتون. ضع الشرائح في حامل غرفة التسامي ، ثم ضع الحامل في جهاز التسامي. قم بوضع محلول المصفوفة المذاب على رقاقة السيراميك واسمح للأسيتون بالتبخر تماما ، ثم أغلق غرفة التسامي لإغلاقها. املأ غرفة التبريد بطين من الماء المثلج وضعها بإحكام فوق غرفة التسامي. قم بتشغيل مضخة التفريغ والسماح للنظام بالتوازن لمدة خمس دقائق. ابدأ التسامي بتسخين الغرفة إلى 200 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة حمام الماء المثلج من الغرفة. اقلب درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية وضع المشتت الحراري فوق الغرفة. قم بالتنفيس ببطء عن غرفة التسامي لتحرير الضغط. افتح الغرفة وقم بإزالة الشرائح بعناية. افتح MicroMS وقم بإزالة صور الفحص المجهري BigTIFF باستخدام خيار مجموعة الصور لاستيعاب كل من قنوات المجال الساطع والفلورة. انتقل إلى أداة خيارات الكائن الثنائي كبير الحجم واضبط الحد الأقصى والحد الأدنى لحجم الكائن الثنائي كبير الحجم لتحديد نطاق حجم الكائن الثنائي كبير الحجم المقبول. قم بتعيين عتبة قناة التألق لاكتشاف الكائن الثنائي كبير الحجم. حدد قيمة التدوير لتحديد مدى الدائرية التي يجب أن تكون الخلايا المحددة للنظر فيها ، واختر اللون. استخدم خيار البحث عن الكائن الثنائي كبير الحجم للكشف عن الكائنات الثنائية كبيرة الحجم. عند المطالبة، احفظ قائمة الكائن الثنائي كبير الحجم تحت الاسم المطلوب. استخدم أداة Distance Filter لتعيين الحد الأدنى للمسافة بين كل خلية. اختبر الخطأ عبر نقاط الاختبار لتحديد خطأ الإزاحة بدقة. قم بتحميل الشرائح في الجهاز باستخدام محول الشريحة MTP II. بعد العودة إلى الكمبيوتر باستخدام MicroMS ، قم بالوصول إلى كمبيوتر مطياف الكتلة عبر تطبيق سطح المكتب البعيد. إذا كنت تستخدم الأداة لأول مرة، فتحقق من موضعها بالانتقال إلى الأدوات، متبوعا بإعدادات الأداة. في النافذة المنبثقة، اعرض مجموعة الإحداثيات مع موضعيها X وY وحدد كل نقطة من هذه النقاط المحددة في هندسة محول الشرائح II. قم بتحديث مواضع X و Y في نافذة MicroMS. باستخدام كاميرا مقياس الطيف الكتلي وعناصر التحكم في المسرح ، انتقل إلى موقع يمكن التعرف عليه بسهولة على الشريحة وانسخ إحداثيات الأداة. في MicroMS ، حدد نفس الموضع في صورة المجهر ، وانقر بزر الماوس الأيمن ، وأدخل الإحداثيات في النافذة المنبثقة. قم بتقريب الإحداثيات إلى أقرب الأعداد الصحيحة وافصلها بمسافة. بعد إضافة ثلاث نقاط تسجيل ، ستتحول إحدى الدوائر إلى اللون الأحمر ، مما يشير إلى أنها الموضع الأكثر انبعادا من التسجيل. احذف نقطة التسجيل باستخدام Control + انقر بزر الماوس الأيمن وحاول مرة أخرى. ضمن ملف، انتقل إلى حفظ ثم التسجيل لحفظ ملف التسجيل. مع ظهور الكائنات الثنائية كبيرة الحجم على الشريحة، انتقل إلى ملف وحفظ ثم مواضع الأداة لحفظ ملف موضع الأداة، ثم باستخدام برنامج سطح المكتب البعيد، انقل هذا الملف إلى كمبيوتر الأجهزة. افتح ملف XEO المخصص وانسخ محتوياته إلى محول شرائح MTP II . XEO على كمبيوتر الجهاز. احفظ الملف لتحديث هذا الملف الهندسي بمواقع الخلايا. انقر فوق علامة التبويب التنفيذ التلقائي وحدد جديد لإنشاء تشغيل تلقائي جديد. اسحب عبر منطقة العينة المعروضة لتحديد الخلايا وانقر بزر الماوس الأيمن لإضافتها إلى قائمة التحليل. احفظ التشغيل التلقائي وانقر فوق بدء التشغيل التلقائي لبدء الاستحواذ. يوضح هذا الشكل كيف يكشف توصيف قياس الطيف الكتلي MALDI-2 أحادي الخلية عن عدم التجانس الخلوي القائم على الدهون عبر وداخل مناطق الدماغ المتميزة. تقريب وإسقاط متشعب موحد ، أو تحليل UMAP ، يفصل الخلايا حسب منطقة الدماغ ، ويشكل مجموعات مميزة للمخطط والحصين والقشرة. كشفت تجميع لايدن عن أربع مجموعات سكانية فرعية للخلايا القائمة على الدهون. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت توقيعات دهنية خاصة بالكتلة ، مع ملامح كثافة مميزة عبر الدهون المشروحة. أظهرت الأطياف الكتلية من ست خلايا قشرية أيضا اكتشافا ثابتا للدهون عبر الشرائح. علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا القشرية من شرائح مختلفة توزيعات UMAP متداخلة ، مما يشير إلى الحد الأدنى من تأثيرات الدفعات.