استنساخ المكوك القائم على كريسبر: طريقة استنساخ عالية الإنتاجية

نصف بروتوكولنا لطريقة الاستنساخ عالية الإنتاجية ، CRISPRshuttle. والذي يتضمن نقل شظايا الحمض النووي المستهدفة بين النواقل دون الحاجة إلى تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لشظايا الحمض النووي. التقنيات الحالية مثل ضخ البوابة وتضخيم PCR للاستنساخ أحادي المتجه. يتطلب هذا النهج إجراءات محددة للجزء بما في ذلك التصميم الأولي والتحقق من صحة الإفراز. هذه العلامات كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. يزيل مكوك كريسبر تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء نقل شظايا الحمض النووي المستهدفة بين النواقل إلى تفاعلات أنبوب اختبار متسلسلة. تتجاوز هذه الطريقة الحاجة إلى معالجة محددة للجزء وبالتالي تسريع بناء العينة.

[راوي] للبدء ، قم بإعداد مزيج رئيسي لعدد معين من تفاعلات الهضم من خلال الجمع بين الكواشف الموضحة على الشاشة. رتب أنابيب 0.2 مليلتر ذات العلامات الصحيحة في كتلة تبريد من الألومنيوم على الثلج. قم بإعداد المزيج الرئيسي لعدد N من التفاعلات عن طريق خلط كميات مناسبة من المخزن المؤقت CAS9 sgRNA 10 CAS9 والمياه المعالجة ب DEPC. امزج المزيج الرئيسي جيدا وقم بتدويره. Aliquot 3.75 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل أنبوب تفاعل. أضف 0.75 ميكرولتر من 0.03 ميكرومولار PLX 304 ORF بلازميد إلى كل أنبوب ممزوج جيدا واحتضن الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإعداد مزيج رئيسي من خلال الجمع بين 0.14 ميكرولتر من 3.36 ميكرومولار الخطي pBIDC-UASC-pLXvect و 1.8 ميكرولتر من مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع. امزج المزيج الرئيسي جيدا وقم بتدويره. الآن أدخل 1.94 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل أنبوب. أضف 1.66 ميكرولتر من البلازميد المشقوق CAS9 في كل أنبوب. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة ساعة. إذابة الخلايا البكتيرية المختصة على الجليد. أليكوت 10 ميكرولتر من الخلايا المذابة في كل أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 ملليلتر. امزج برفق 10 ميكرولتر من الخلايا المختصة مع ميكرولتر واحد من منتج تجميع جيبسون. ضع الأنابيب على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بصدمة الأنابيب بالحرارة على حرارة 42 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم تبرد على الثلج لمدة دقيقتين. أضف 100 ميكرولتر من وسط SOC المسخن مسبقا في كل أنبوب ورجه عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، ضع الخلايا على ألواح LB agar تحتوي على 15 ميكروغراما لكل مليلتر من الكلورامفينيكول واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. يعرض هذا الشكل النتائج التمثيلية من تحليل التقييد لبلازميدات UAS-cDNA / ORF التي تم إنشاؤها باستخدام نظام CRISPRshuttle. في هذا التحليل ، كشف هضم تقييد 15 بنية UAS-cDNA / ORF باستخدام PVU2 أن جميع العينات عرضت أنماط الأجزاء المتوقعة عند ما يقرب من 1072 زوجا أساسيا و 1,820 زوجا أساسيا.