التنميط المكاني الشامل للنسخ غير الحيادية للأنواع عبر Stereo-seq

يركز بحثنا على توصيف البيئة الدقيقة لورم المبيض بالتفصيل لتحديد العلامات الحيوية التنبؤية والعلاجية. على سبيل المثال، نرغب في إيجاد علامات للتنبؤ باستجابة العلاج الكيميائي ومقاومتها أو أهداف علاجية جديدة للعلاجات من الخط الثاني. تشمل التحديات التجريبية التعامل مع العينة، وتقييم جودة العينة، ومدة معالجة العينة.

أما في جانب تحليل البيانات، فتشمل التحديات أشياء مثل ندرة البيانات، مشابهة لعمليات الخلايا المفردة الأخرى، أو أيضا رسم خرائط المناطق، خاصة المناطق المتكررة. بعد إزالة شريحة N-Chip ذات تسلسل الستيريو من تغليفها، سجل رقم تعريف الشريحة. دون لمس سطح شريحة N، نظف شريحة الزجاج بنسبة 100٪ إيثانول.

باستخدام ماصة دقيقة، قم بتطبيق 10 ميكرولترات من راتنج السيراميك القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية بعناية حول حافة شريحة N-Chip ذات التسلسل الستيريو. استخدم مسحة رغوة محكمة الإغلاق لإزالة الراتنج الزائد، مع ترك خط رفيع فقط حول حافة الشريحة. ضع السلايد في جهاز المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية، لضمان عدم لمس سطح الشريحة.

الآن ضع الشريحة المطبقة بالراتنج فوق قناع معتم على مصدر الضوء فوق البنفسجي بقطر 405 نانومتر لإضاءة الجزء الخلفي من الشريحة، وتجد لمدة خمس دقائق. بعد التصلب، استخدم مسحات رغوية محكمة الإغلاق منقوعة في 100٪ إيثانول جزيئي، ثم 70٪ إيثانول، وأخيرا ماء خال من النوكلياز لتنظيف الحافة المطبقة بالراتنج. اغمر الشريحة ثلاث مرات في ماء نقي خال من النوكلياز باستخدام أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.

باستخدام الهواء المضغوط، جفف الشريحة بكامل قوة الهواء بزاوية تقارب 60 إلى 80 درجة، مع تحريك قطري عبر السطح من مسافة حوالي خمسة سنتيمترات. بعد ذلك، ضع 150 ميكرولتر من محلول بولي-إل-ليسين بشكل متساو على كامل سطح الشريحة، وحضن الشريحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أزيل محلول بولي-إل-ليسين من الشريحة.

بعد الغسل الثاني، جفف حواف السلايد بعناية دون لمس سطح الشرائح. جفف الشريحة جيدا باستخدام الهواء المضغوط كما أوضح سابقا. أثناء تقسيم نسيج FFPE، لا تلمس الشريحة مباشرة، وغط فقط 80٪ من الشريحة بالمنديل.

لتحضير ميكرولترين من محلول تلوين الحمض النووي أحادي السلسلة في مخزن SSC، قم بتخفيف كاشف الحمض النووي أحادي السلسلة من الكيوبت باستخدام 5X SSC. أنشئ مزيجا رئيسيا من محلول التلوين باستخدام تخفيف من واحد إلى 20 من مثبط الريبونوكلياز، وتخفيف من واحد إلى 200 لمحلول الحمض النووي أحادي السلسلة، والحجم المتبقي باستخدام 5X SSC buffer. أضف 150 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل شريحة وحضن في الظلام على درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم أزل محلول التلوين بلطف من زاوية كل شريحة باستخدام ماصحة. بعد غسل الشريحة مرتين باستخدام مخزن SSC 0.1X لمدة 10 إلى 15 ثانية، جفف حواف السلايد بعناية. أضف حوالي ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من الجلسرول على الشريحة لتركيبها.

أنزل غطاء من حوالي سنتيمتر واحد فوق الشريحة، مع الحفاظ على مستواها، والتأكد من عدم ملامستها لسطح الشريحة. التقاط صور فلورية لأنسجة ملطخة بالحمض النووي أحادية السلسلة باستخدام مجهر واسع المجال، مع ضمان تداخل بنسبة 10٪ بين بلاطات الصورة. قم بخياطة الصور المكتسبة في برامج معالجة الصور مثل ImageJ أولا باستخدام التداخل النظري لتوليد مواقع تقريبية للبلاطات، ثم تطبيق التداخل الحسابي المطابق مع البكسل لضبط التبليط.

قم بمعالجة الصور المخيطة في برنامج StereoMap، وتأكد من أن مراقبة جودة الصورة تمر قبل المتابعة. اغمر شريحة تسلسل الستيريو في 30 ملليلتر من مخزن SSC 0.1X حتى ينفصل غطاء الغطاء (coverslip). تأكد من أن مادة فك الربط FFPE في درجة حرارة الغرفة وفحصها بحثا عن جزيئات.

شغل جهاز التدوير الحراري واضبطه على 30 درجة مئوية للتوازن، و95 درجة مئوية لحضانة مدتها 30 دقيقة، وثبات لا نهائي عند أربع درجات مئوية. قم بتجميع حشية الكاسيت وضع شريحة التسلسل الستيريو داخل الكاسيت. ثم أضف مادة فك الربط FFPE إلى بئر شريط السلايد، وطبق شريط ختم على الكاسيت وتأكد من أنه مغلق بإحكام.

ابدأ الحضانة التي تستمر 30 دقيقة عند 95 درجة مئوية. بعد 10 دقائق، ضع 25 ملليتر من الميثانول في حاوية سعة 50 ملليتر في فريزر بدرجة حرارة 20 درجة مئوية، مع تحضير حوالي ملليلتر واحد لكل شريحة للاستخدام لاحقا. بعد إزالة الشريحة من جهاز التسخين الحراري، انقل شريط الشريط إلى الطاولة وقشر شريط الختم.

باستخدام معصية، قم بإزالة وتخلص من مادة فك الربط FFPE من الكاسيت. بمجرد إزالة المادة الكيميائية بالكامل، قم بفصل الكاسيت والحشية وتخلص منهما. تحت غطاء بخار معقم، جفف حافة السلايد، ووضع حجرة سيليكون جديدة إذا لزم الأمر.

أضف 500 ميكرولتر من الميثانول المبرد من فريزر 20 درجة مئوية، مما يضمن غمر القسم بأكمله. محلول بري بارد مسبق التسخين على كتلة جاف بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام. بعد التثبيت، في غطاء بخار، امسح أي فائض من الميثانول من الشريحة وانتظر حتى يتبخر الميثانول المتبقي على الشريحة.

قم بتجميع حشية نهاية كاسيت جديدة. بمجرد اكتمال التبخر، ضع شريحة التسلسل الستيريو داخل الكاسيت. أضف 200 ميكرولتر من مادة النفاذية المسخنة مسبقا إلى الشريحة.

ضع شريط ختم على شريط السلايدات المتسلسل الستيريو وتأكد من إحكام إحكامه. قم بإجراء النسخ العكسي ثم إطلاق CDNA والتنقية باتباع الخطوات الموضحة هنا. قم بتسخين الماء الخالي من النوكلياز إلى 37 درجة مئوية.

أزل الختم من الشريحة. ضع البيبيتي بقوة في كل زاوية وفي وسط الشريحة فوق المنديل دون كشط أو لمس. اجمع كل خليط إطلاق الحمض النووي المجاني من الشريحة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 أو 2.0 ملليتر.

أضف 350 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز المسخن مباشرة إلى سطح الشريحة. قم بعمل معصمة بقوة باستخدام منارة أصغر، مع توجيه الطرف لتطبيق قوة قوية دون لمس النسيج أو خدش الشريحة. اجمع الغسيل مع 400 ميكرولتر من خليط إطلاق الحمض النووي المجاني الذي تم جمعه سابقا، لضمان دمج مواد من شريحة واحدة فقط.

ضع 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز على الشريحة. أغلق شريحة التسلسل الستيريو، واحتفظ بها في الثلاجة حتى نهاية البروتوكول. تم تحقيق تقسيم خلية واحدة باستخدام خط أنابيب SAW على مقاطع FFPE، مما مكن من رسم الخرائط إلى RNA غير متعددة الأدينيل مثل tRNA وTRDMT1.

أظهر التصور المكاني التفاعلي أنواع الخلايا المفترض باستخدام البرنامج الملكي StereoMap، مع عرض تجمعات بألوان مختلفة عبر منطقة مكبرة من النسيج. تم تصور التعبير الكامل عن النسيج الريبي TRDMT1 غير متعدد الأدينيل باستخدام StereoPi. تعالج تعديلات البروتوكول القضايا التي واجهناها في التحليل المكاني الكامل للأنسجة الدهنية والهشة من خلال تحسين التصاق الأنسجة، وسهولة الوصول إلى الحمض النووي الريبي، والتعامل مع المقاطع الستيريو-سيqs على هذه الأنسجة الصعبة.

يوفر نظام التصوير الستيريو-سكي حاليا دقة أعلى من طرق النسخ المكاني الأخرى بدقة 500 نانومتر مقارنة بميكرونتين. كما يوفر الالتقاط غير المتحيز المطلوب لدراسة الميكروبيوم والفيروسات والنسخ غير البولي أدينيلية.