طريقة تصوير بصري متوافقة مع المجهر الإلكتروني الماسح لرسم خرائط الدماغ لجميع الخلايا بالمنظار

يركز بحثنا على علم الكونكتوميكس. نطور منهجيات التقاط الصور البصرية أو الإلكترونية عالية الإنتاجية، مما يمكن تحليل دوائر عصبية وميزات الاتصال التشابكي لفك المنطق الأساسي للاتصال في الدوائر العصبية. الكونكتوميكس الأصلية ذات الثورة العالية تقتصر على أحجام صغيرة من الدماغ بسبب جمع البيانات المكلف وبدقة، بينما يوفر التحليل المجهري السريع والدراسة المجهرية المستهدفة إمكانات لاتصالات الدماغ بالكامل.

مقارنة بالطرق المجهرية الأخرى، مثل مجاهر لارسن المختلفة، يلتقط OMLIT صورا لجميع الخلايا العصبية التي تحتوي على معلومات عن التغصنات والمحاور العصبية. بالإضافة إلى توافقه مع المجهر الإلكتروني، هناك تصوير بدقة نانوية إضافي تحت EF. يساعد OMLIT في بناء نماذج دماغية شاملة، حيث يرسم جميع الإسقاطات طويلة المدى، بما في ذلك اتجاهها وقوتها وننوعها جنبا إلى جنب مع الدوائر الدقيقة المحلية بالتزامن مع الموضوع التسلسلي. يقدم نظرة على البنية المنظمة وتدفق المعلومات عبر الدماغ بأكمله.

نحن نطور التصوير الآلي لنظام OMLIT وجمع بيانات EM بتوجيه من خلال التحليل الصناعي المعرف ب OMLIT، مما يتيح جمع وتحليل بيانات الاتصال المتصل بكفاءة عبر أحجام دماغية كبيرة أو كاملة. للبدء، اختر إما فيلم كابتون أو D50 بسماكة 50 ميكرومتر ومركبة على نظام اللف المحرك. باستخدام نظام رذاذ ماجنترون ذو رأسين مزدوجين، يتم وضع طبقة رقيقة منتظمة من الكروم أو معادن أخرى مثل الألمنيوم أو الفضة أو النحاس على سطح الشريط.

ضع الشريط على مسافة 80 مليمتر من الهدف المتقطع. قم بتنفيذ العملية تحت طاقة تيار مستمر، وبضغط باسكال واحد منظم بغاز الأرجون بنسبة 99.99٪. الآن، اضبط سرعة لف الشريط إلى 0.6 مليمتر في الثانية لتحقيق سمك طلاء معدني يبلغ 50 نانومتر.

بعد الترسب، أخرج الشريط من النظام بمجرد أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. قيم سمك وتجانس الطلاء، باستخدام جهاز تحليل القلم أو المجهر بالقوة الذرية، أو المجهر الإلكتروني الماسح. لاستراتيجية الانعكاسية المنخفضة، قم بتنظيف وجعل الشريط محبا للماء باستخدام منظف بلازما بقوة 80 واط مع تحريك الشريط بسرعة سبعة مليمترات في الثانية.

بعد المعالجة، ضع قطرات الماء على سطح الشريط للتأكد من انتشارها بسرعة إلى طبقة رقيقة. باستخدام مطحنة صغيرة أو أداة قطع مشابهة، قم بقص الراتنج بشكل تقريبي من جانب العينة لإزالة الراتنج الفارغ المحيط وكشف منطقة العينة. ضع الكتلة المدمجة في الراتنج في حامل العينة وشدها لتثبيت الكتلة بإحكام.

ثبت حامل العينات على ذراع الميكروتوم المتحركة. قم بتركيب سكين زجاجي أو سكين تقليم من الألماس بزاوية 45 درجة على حامل السكين. تحت المجهر، قم بقص سطح العينة على شكل هرم وقم بتسويته، ثم قم بقص وتنعيم الجوانب الأربعة لإزالة الراتنج الزائد.

قم بتدوير المقبض لمحاذاة الحواف الأمامية والخلفية للكتلة في وضع أفقي. أزل سكين التشطيم واستبدله بسكين ألماس، مثبت بزاوية 45 درجة. اضبط زاوية ميل قاعدة الميكروتوم إلى ست درجات وحرك حامل السكين ببطء باستخدام المقبض حتى تصبح الحافة الأمامية للسكين من ملليمتر إلى مليمتر واحد إلى اثنين من سطح العينة.

راقب الشريط الساطع بين سطح العينة وحافة السكين، وضبط زاوية الإمالة بحيث يكون الشريط متساويا من الأعلى إلى الأسفل ومن جانب إلى جانب. الآن، حقن الماء المقطر في أخدود سكين الألماس لترطيب الشفرة. أزل بعض الماء باستخدام حقنة حتى ينخفض مستوى السائل ويبدو الانعكاس فضيا.

بعد ذلك، اضبط سمك القسم، سرعة القطع، ونافذة القطع في وحدة التحكم. اضبط سرعة التقسيم إلى 0.6 مليمتر في الثانية وسمك المقطع إلى 60 نانومتر، حسب جودة العينة. ابدأ التقسيم باستخدام الميكروتوم.

بمجرد إنتاج مقاطع مستقرة وموحدة، أوقف العملية مؤقتا. ثم استخدم فرشاة دقيقة لإزالة الأجزاء المقطوعة والحطام. الآن قم بتركيب كل من بكرة الشريط المطلي وبكرة السحب الفارغة على نظام جمع القطع الأوتوماتيكي فائق الرقة.

قم بتثبيت آلية القفل وإجراء تجربة للتأكد من حركة الشريط السلسة بسرعة ثابتة والجمع الصحيح على بكرة الجمع. اغمر رأس الجمع في حمام الماء الخاص بسكين الألماس واضبط الرأس ليكون موازيا لحافة السكين بطول 1.5 ضعف طول شريحة العينة. أمن جهاز الجمع واستأنف التقسيم، مع تشغيل جهاز جمع الشريط في نفس الوقت.

بعد جمع مقاطع مستمرة كافية، أوقف التقسيم مؤقتا. اقطع الشريط في منطقة بدون أقسام. شغل جهاز جمع الشريط حتى يتم تثبيت كل الشريط على البكرة.

بعد ذلك، قم بإزالة البكرة وضعها في فرن تجفيف إلكتروني. نظف جهاز جمع الأشرطة والميكروتوم وأعد جميع الملحقات إلى أماكنها الصحيحة. للتركيب على رقاقة سيليكون، قم بنزع الفيلم الواقي الشفاف عن الشريط الموصل مزدوج الوجه.

قم بتطبيق الشريط بشكل مواز على الشريط الموصل ذو الوجهين، مع وضع ما يصل إلى ثلاثة أجزاء من الشريط على كل قطعة. ضع رقاقة السيليكون على منصة المجهر البصري، وثبتها بشريط لاصق غير بقايا. استخدم عدسة موضوعية بحجم خمسة X للحصول على صورة عامة لشريحة السيليكون، والشريط الريفي، والعينة.

على الصورة العامة، قم برسم مخطط لكل قسم ورتبه، ثم أضف نقاط التركيز والتعريض لإجراء تصوير تلقائي بتكبير 20 أو 50 ضعف عبر كامل الرقاقة. بعد التصوير، احفظ الصور وتحقق من جودتها، وأعد التركيز وإعادة التصوير إذا كانت أي منها غير واضحة أو ذات جودة ضعيفة. استيراد مكدس صور TIFF إلى VAST 22 عن طريق اختيار استيراد، ثم استيراد حجم الصور من الصور إلى ملف VSV.

قم بتوصيل جهاز لوحي خارجي واستخدم أداة الفرشاة ووضع رسم المقاطع لتقسيم وتتبع الهياكل يدويا. استخدم مفاتيح الاختصار A و Z للتنقل بين شرائح الصورة. الآن، تصور الهيكل المقسم في ثلاثة أبعاد باختيار النافذة، ثم العرض ثلاثي الأبعاد، ثم العرض والتحديث.

أخيرا، احفظ نتائج التقسيم بعد اختيار الملف وحفظ التقسيم. في الصور ذات الانعكاسية العالية، أظهرت مناطق التجويف السيتوبلازمي والأوعائي شدة أعلى مقارنة بالمناطق المحيطة، بينما في الصور ذات الانعكاسية المنخفضة، أظهرت مناطق التجويف السيتوبلازمي والأوعائي شدة أقل. أظهرت النتائج الكمية أن استراتيجيات الانعكاسية العالية والمنخفضة.

كان لكل منهما مزايا من حيث التباين وفوضى المعلومات. سمح تصوير المجهر البصري عبر OMLIT بتحديد المحاور العصبية والأوعية الدموية وأجسام الخلايا والتغصنات الشغبية. أظهر التقسيم اليدوي لصور الأومليت باستخدام VAST العديد من أجسام الخلايا المتقاربة والتغصنات والمحاور العصبية المرتبة بإحكام.

تم دمج النتائج المقسمة مع الصورة الأصلية لإنتاج تصور ثلاثي الأبعاد. أظهرت صور OMLIT المكبرة دقة غير كافية لكشف هياكل أدق. كشفت صور المجهر الإلكتروني لنفس المنطقة عن المشابك العصبية والميتوكوندريا ونوى الخلايا والحويصلات.