تحليل النوع الفرعي للخلية لبروتيزوم الغشاء العصبي في الخلايا العصبية الحسية الجسدية

نحن نبحث في آليات كيفية تواصل الخلايا العصبية الحسية الجسدية من خلال الغشاء العصبي المكتشف مؤخرا بروتيزوم أو NNP لتعديل كيفية شعورنا باللمس والحكة والألم. اكتشفنا مؤخرا الغشاء العصبي بروتيزوم ، وهو مركب متخصص لتحلل البروتين موجود في بعض الخلايا العصبية الحسية ، والذي يعمل على تعديل الحساسية للمس والحكة والألم. باستخدام هذا البروتوكول ، سنكون قادرين على التحقيق في ديناميكيات التعبير والتعديل ل NMP بطريقة محددة من نوع الخلية في الظروف الصحية والمرضية.

يتيح بروتوكولنا عزل الخلايا العصبية التي تعبر عن NMP من الخلايا العصبية غير NMP لتكون قادرة على دراسة وظيفتها بخصوصية نوع الخلية. الأهم من ذلك ، أن هذه المجموعات العصبية المعزولة تظل قابلة للتطبيق للتحليلات النهائية. باستخدام هذه البروتوكولات ، سنبدأ في التحقيق في كيفية تأثير حالات الاعتلال العصبي المختلفة على التعبير عن NMP ووظيفته ، وكيف يساهم ذلك في تغيير اللمس والحكة والإحساس بالألم.

للبدء ، انقل العقد الجذرية الظهرية المحصودة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. باستخدام ماصة ، أضف سبعة ملليلتر من محلول عمل مزيج إنزيم تفكك الأنسجة إلى الأنبوب واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف لمدة 20 دقيقة. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي وقم بتدوير العقد على حرارة 120 جم لمدة دقيقتين.

استنشاق المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق العقد في سبعة ملليلتر من مزيج إنزيم تفكك الأنسجة منخفض التثبيث مع غراء. بعد طرد الأنبوب مرة أخرى ، قم بشفط المادة الطافية وتخلص منها.

ثم أعد تعليق العقد في 500 ميكرولتر من محلول BSA و TI و DEM. باستخدام ماصة مرعى زجاجية مصقولة بملليلتر واحد ، قم بتشويه العقد من 12 إلى 16 مرة. مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لتصفية الحطام الخلوي.

اغسل المصفاة بملليلتر واحد من محلول BSA و TI و DMEM لجمع الخلايا العصبية المتبقية للعقد الجذرية الظهرية. انقل تعليق الخلية المفلتر إلى أنبوب مخروطي 15 مل. قم بإعداد صينية تلطيخ مضان مناعي عن طريق تبطينها بقطعة كبيرة من البارافيلم.

باستخدام ملقط معقم من 5 إلى 45 ، انقل انزلاقات الغطاء من طبق زراعة الأنسجة إلى البارافيلم ، مما يضمن أن الجانب الذي يحتوي على الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية متجها لأعلى. ضع ماصة ببطء 100 ميكرولتر من وسائط العقد الجذرية الظهرية على كل غطاء للانزلاق لمنع الخلايا من الجفاف. ثم قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي لمكافحة PSM alpha في وسط العقد الجذرية الظهرية الدافئة لتحقيق تخفيف من واحد إلى 20.

باستخدام شفاط مزود بطرف P10 غير مفلتر ، قم بإزالة الوسائط ببطء من حافة كل شريحة غطاء. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لمضاد PSM alpha اثنين إلى كل غطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول الأجسام المضادة الأساسي بعناية من كل زلة غطاء.

أضف 100 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى الخلايا واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق لغسلها. الآن ، لتحضير الجسم المضاد الثانوي المضاد للذهاب ، قم بتخفيفه في وسط عقد الجذر الظهري الدافئ عند تخفيف واحد إلى 250. بعد الانتهاء من الغسيل الثالث ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى كل زلة غطاء.

احتضان انزلاقات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة مع حماية الخلايا من الضوء. ثم استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي من انزلاق الغطاء واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل النهائي PBS ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت الذي يحتوي على 4٪ من الفورمالديهايد ، و 4٪ سكروز في PBS.

بمجرد تحضين الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، استنشط المثبت من كل شريحة غطاء. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS كما هو موضح سابقا. لتخلل الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من المنظفات غير الأيونية 0.1٪ في برنامج تلفزيوني.

احتضان الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم استنشق المحلول القابل للاختراق من انزلاقات الغطاء واغسل الخلايا ثلاث مرات ، باستخدام PBS كما هو موضح سابقا. أضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب المكون من 5٪ مصل بقري جنيني ، و 5٪ مصل الحمير في PBS لكل زلة غطاء.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الأرانب المضادة ل CGRP ، و A selectin B أربعة مقترن من البيوتين ، والدجاج المضاد ل NFH في محلول الحظر لتحضير خليط الأجسام المضادة الأولية المحددة لنوع الخلايا العصبية العقدية للجذر الظهري. استنشق محلول الانسداد من زلات الغطاء ، ثم أضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية المحضر إلى كل زلة غطاء. احتضن زلات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع حمايتها من الضوء.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من زلات الغطاء واغسل الخلايا ثلاث مرات ، باستخدام PBS كما هو موضح سابقا. الآن قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الثانوي عن طريق تخفيف الستربتافيدين ، والحمار المضاد للأرانب ، والحمار المضادة للدجاج إلى واحد إلى 500 لكل منها في محلول الحظر. استنشق غسول PBS النهائي من كل قلة غطاء ، ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المحضر.

احتضان زلات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في الظلام. استنشق الغسيل النهائي من زلة الغطاء. باستخدام ملقط ذو طرف ناعم ، ارفع كل غطاء من البارافيلم وامسح السوائل الزائدة برفق عن طريق لمس حافة الغطاء إلى منديل خال من النسالة.

ضع قطرة سبعة ميكرولتر من وسط التثبيت على شريحة مجهر. قم بخفض انزلاق الغطاء بعناية على وسط التثبيت بحيث يكون جانب الخلية متجها لأسفل ، مما يضمن التلامس الكامل مع الوسط. ضع الشرائح المحضرة في درج أو صندوق جاف داكن حتى تجف لمدة ساعة على الأقل.

أغلق حافة الغطاء بطلاء أظافر سريع الجفاف وانتظر من 10 إلى 15 دقيقة قبل التصوير. كشفت الأجسام المضادة التي تتغذى على الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية الحية عن مجموعة سكانية فرعية من الخلايا العصبية مع البروتيازوم التي يمكن الوصول إليها على السطح ، بينما أظهرت عينات التحكم التي تفتقر إلى الأجسام المضادة الأولية عدم وجود علامات سطحية. حدد قياس التدفق الخلوي مجموعتين متميزتين من الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية ، بناء على شدة التألق ، وفصل الخلايا الإيجابية NMP عن الخلايا السالبة NMP مع إنشاء مناطق بوابات واضحة ، باستخدام عناصر التحكم.

أظهر القياس الكمي للمجموعات السكانية التي تم فرزها التدفق أن ما يقرب من 4٪ من الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية كانت إيجابية NMP ، بينما كانت الغالبية المتبقية سلبية NMP. احتفظت الخلايا العصبية الإيجابية NMP و NMP السلبية المصنفة بقابلية البقاء وأعربت عن علامات محددة لنوع الخلية NFH و IB أربعة و CGRP ، مما يؤكد ملاءمة سير العمل للتحليل الجزيئي النهائي.