إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز
September 17th, 2011
تم وصف طريقة لإعداد نشطة translationally ، synaptoneurosomes سليمة (SNS) من قشرة دماغ الفأر. الأسلوب يستخدم متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز السماح للتحضير السريع لSNS النشطة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد المشبك النشط الانتقالي للمناطق العصبية من قشرة دماغ الفأر ، باستخدام تدرج كثافة السكروز المحيطي المتقطع. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع وتجانس قشرة الفأر أولا ، ثم الطرد المركزي المتجانس. بعد ذلك ، قم بتطبيق متجانس جهاز الطرد المركزي ، أو sup natant على التقرير.
الخطوة الأخيرة هي الطرد المركزي وجمع جزء المشبب. في النهاية ، يظهر تحليل اللطخة الغربية وتجارب دمج الميثيونين S 35 أن جزء المشبكي غني متشابك ونشط ترجميا. المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الطرد المركزي والترشيح ، يتم تجنب الضرر الميكانيكي الأول من خلال استخدام تدرجات الكثافة ، والثانية لكل مكالمة لها سمية منخفضة تجاه الخلايا في مكوناتها.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع هذا البروتوكول لأن التوقيت يلعب دورا رئيسيا. بمجرد حصاد الكورتيس ، يجب إكمال الإجراء بسرعة. لبدء الإجراء ، قم بإعداد طبقات التدرج 3 و 10 و 15 و 23٪ عن طريق إضافة الكميات الخاصة من SIP كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة إلى المخزن المؤقت GM واخلطها جيدا.
صب طبقات التدرج عن طريق سحب ملليلترين من كل من محاليل البيرول المتساوية 23 15 و 10 و 3٪ في أنابيب الطرد المركزي بيكمان ذات الأغطية. باستخدام ماصة P 1000 ، يجب أن تكون الواجهة بين الطبقات واضحة مع عدم خلط الطبقات. قم بتخزين التدرجات الأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد الحلول الضرورية الأخرى كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة. قتل الفأر في سن 13 إلى ص 21 وإعداده للتشريح عن طريق رش الجزء الخلفي من الرقبة والرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم مقصا حادا لقطع الحبل الشوكي عند قاعدة الجمجمة.
بعد ذلك ، قم بإزالة الجلد من أعلى الجمجمة. قطع الجمجمة بشكل جانبي بين العظم الجداري والعظم الجداري ، أو بين مناطق المخ والقشرة. بعد ذلك ، قم بقطع الجمجمة من القاعدة إلى الأنف على طول الخيط السهمي.
في هذه الخطوة ، قم بإزالة العظم الجداري الناعم بعناية عن طريق سحب كل نصف كرة إلى الجانب. بعد ذلك ، أدخل الملعقة في الدماغ فوق المخيخ لاستخراج القشرة. ضعه في مخزن مؤقت GM بارد ، وكرر الإجراءات مرة أخرى لجمع المزيد من القشرية.
الآن شطف القشرة في المثلج الباردة GM العازلة. ثم انقل قشرتين إلى الخالط الزجاجي السفلي الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المعدل وراثيا البارد. قم بتجانس القشرة برفق بخمس إلى 10 ضربات من المدقة A ، والمدقة السائبة متبوعة بخمس إلى 10 ضربات من المدقة B ، نوع المدقة
يختلف عدد السكتات الدماغية حسب الخالط الفردي. انقل الجانس إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي في 1000 مرة.
الجاذبية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي Allegra six KR لحبيبات الحطام الخلوي والنوى. ضع طبقة ملليلترين من السوبينات لكل تدرج أو سكروز مع تدرج واحد لكل قشرة كاملة وغطاء الأنابيب. ثم قم بطردها في دوار بزاوية ثابتة عند 32،500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي بيكمان J 2 21.
باستخدام المحولات المناسبة عند اكتمالها، يجب أن يعطي التدرج ماصة قوية لنطاق SN والتخلص من المحلول فوق نطاق SN. باستخدام ماصات ماصة المعكرونة الزجاجية من نطاق SN عند الواجهة من 15 إلى 23٪، يعطي التدرج الواحد عموما حوالي 0.9 إلى 1.1 ملليلتر من SNS. بعد ذلك ، انقله إلى أنبوب مخروطي الشكل وتخزينه على الجليد.
ثم اضبط تركيز الملح ل SNS عن طريق إضافة حجم 10 من 10 مرات المخزن المؤقت للتحفيز. اختياريا أضف 1000 مرة من كلوريد الكالسيوم لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 12 دولة. بعد ذلك ، أضف مخزونا واحدا من مخزون TTX المليمولار لإعطاء تركيز نهائي من ميكرومولار واحد لقمع الإثارة غير المحددة.
الخطوة التالية هي استخدام SNS في تطبيق المصب القابل للتطبيق ، مثل دراسات ترجمة البروتين. بالنسبة للتطبيقات الأخرى ، يمكن تنظيف محللة SN أو تركيزها باستخدام مجموعة أدوات إعداد عينة صفحة Pierce SDS. يمكن تحديد تركيز البروتين في SNS باستخدام مجموعة فحص البروتين micro BCA.
فيما يلي مثال على ستة نطاقات أو كسور. عندما تم تجانس قشرة الفأر وفصلها على تدرجات سكروز بيرول المتقطعة ، تم احتواء SNS المخصب في النطاق الخامس عند واجهة 23 إلى 15٪ ، تمت إزالة هذا النطاق وفحصه بواسطة المجهر الإلكتروني. يظهر هنا مثال على الحويصلات المشبكية السليمة والحفاظ على العناصر قبل التشابك وما بعد التشابك في اللطخة الغربية.
تظهر زيادة في العلامات المشبكية وانخفاض الشوائب في نطاق SN من تدرج متقطع لكل سكروز لتأكيد أن الزيادة في دمج الميثيونين S 35 عند إضافة الغلوتامات ترجع إلى تخليق البروتين دي نوفو. تمت إضافة 40 ميكرومولار الوعيذ مايسين ، وهو مثبط لتخليق البروتين. يوضح هذا الشكل الانخفاض الملحوظ في دمج الميثيونين S 35 في وجود أنسو مايسين مع أو بدون الغلوتامات الموجودة عند مقارنتها بالمستويات القاعدية.
وبالتالي ، فإن تدرجات السكروز المحيطية المتقطعة تنتج بسرعة SNS نشطة للغاية ونقية نسبيا يمكن استخدامها لدراسة ترجمة البروتين. يوضح هذا الشكل أن النطاق الخامس من التدرج المتقطع لكل قلب من السكروز يحتوي على أعلى مستويات تخليق البروتين من جديد. تحتوي SNS المحضرة عن طريق تمرير القشرة المتجانسة من خلال سلسلة من المرشحات ذات حجم المسام المتناقص ثم الطرد المركزي على تدرج سكروز متقطع لكل نواة للمقارنة على أغشية مكسورة أكثر وأقل SNS كاملة من SNS المحضرة من طريقة تدرج السكروز البيرول المتقطعة SNS المحضرة باستخدام طريقة تدرج السكروز المحيطي المتقطع التي تم إعدادها على المزيد من نشاط تخليق البروتين من جديد ثم SNS المحضر باستخدام طريقة الترشيح.
تبين أن SNS المحضرة من الفئران الأصغر سنا لها نشاط انتقالي أكبر من الفئران الأكبر سنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل المناطق العصبية المشبكية النشطة ترجميا عن طريق تجانس قشرة الفأر بالطرد المركزي للمتجانس في دوار دلو متأرجح ، والطرد المركزي للطافي فوق تدرج السكروز لكل مكالمة في دوار بزاوية ثابتة ، ثم جمع نطاق المنطقة العصبية المشبكية الناتج.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لتحضير الـ synaptoneurosomes الفعّالة ترجمة من قشرة دماغ الفأر باستخدام تدرج كثافة غير مستمر من Percoll-سكروز. تسمح هذه التقنية بتحضير سريع مع تقليل الضرر الميكانيكي والسمية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الكيمياء الحيوية
الخلفية
- الـ synaptoneurosomes ضرورية لدراسة وظيفة المشابك.
- قد تسبب الطرق التقليدية تلفًا ميكانيكيًا للعينات.
- يمكن أن تقلل تدرجات الكثافة من السمية للخلايا.
- فهم النشاط الانتقالي في المشابك أمر بالغ الأهمية لأبحاث علم الأعصاب.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة موثوقة لعزل synaptoneurosomes الفعّالة.
- لتحسين جودة تحضيرات الـ synaptosome للبحث.
- لتسهل الدراسات الإضافية على الوظائف والميكانيكا المشبكية.
الطرق المستخدمة
- تجانس قشور دماغ الفأر.
- طرد مركزي للمتجانس لفصل المكونات.
- تطبيق المحلول الفائق على تدرجات Percoll-سكروز.
- طرد مركزي نهائي لجمع جزء الـ synaptosome.
النتائج الرئيسية
- أكدت تحليلات Western blot الإثراء المشبكي للجزء.
- أظهرت تجارب دمج S35 ميثيونين النشاط الانتقالي.
- تعمل هذه الطريقة بشكل فعال على تقليل الضرر الميكانيكي مقارنة بالتقنيات التقليدية.
- تعزز سمية Percoll المنخفضة قابلية خلايا التحضيرات للحياة.
الاستنتاجات
- الطريقة الموصوفة فعالة لتحضير synaptoneurosomes فعّالة.
- توفر أداة موثوقة لدراسة الميكانيكا المشبكية.
- يمكن أن يبني البحث المستقبلي على هذه التقنية لتطبيقات متنوعة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Synaptoneurosome isolation enables mechanistic de-risking of synaptic targets by preserving native pre- and postsynaptic protein complexes. This method supports target validation in neuroscience drug discovery by providing translationally active preparations that reflect physiological neurotransmitter handling. The Percoll-sucrose gradient approach reduces artifacts from mechanical damage and cytotoxicity, improving data reliability for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by maintaining synaptic vesicle uptake, storage, and release machinery.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of neurotransmitter dynamics in resealed terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying de novo protein synthesis via S35 methionine incorporation as a translational activity readout.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assays measuring synaptic protein translation or drug effects on vesicle cycling.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible SN yields (0.9–1.1 mL per cortex) with minimal batch variability due to controlled gradient layering.
- Assay Readiness: Provides scalability for compound screening platforms requiring intact synaptic terminals with preserved pre- and postsynaptic markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant synaptic protein complexes from discovery through preclinical validation of CNS-targeted modulators.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target mechanism by correlating glutamate-stimulated S35 methionine incorporation with synaptic vesicle cycling.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on translational activity levels, which are higher in juvenile (P13–P21) mouse cortices and reduced by protein synthesis inhibitors like anisomycin.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, where synaptic functional assays inform compound prioritization before preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating synaptically enriched fractions validated via western blot for synaptic markers and reduced impurity profiles.
- Screening: Delivers assay-ready SNs with quantitative outputs such as S35 methionine incorporation rates, enabling comparison of compound effects on protein synthesis.
- Analytics: Generates translational activity measurements that help teams compare synaptic functional states across conditions or genetic models.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving synaptic vesicle cycling machinery relevant to biomarker alignment in neurodegenerative or neuropsychiatric indications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cortical SN preparation platform applicable across multiple projects studying synaptic protein translation or drug-induced modulation of vesicle dynamics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in synaptic target engagement through preserved neurotransmitter uptake, storage, and release capabilities.
- Operational Value: Standardization via isotonic Percoll-sucrose gradients that avoid cytotoxic media and reduce centrifugation steps, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by quantifying translational activity as a functional synaptic readout, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent effects on SN protein synthesis, supporting capital efficiency in target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, homogenization technique, and density gradient preparation to avoid cortical damage and ensure sharp layer interfaces.
- Dependent on centrifugation infrastructure (swinging bucket and fixed angle rotors) and temperature control (4°C) throughout processing to maintain SN integrity.
- Necessitates cross-team standardization of homogenization stroke counts and gradient layer volumes to minimize inter-user variability in SN yield and activity.
- Adaptation considerations include adjusting P13–P21 mouse age for developmental synaptic profiles and optimizing TTX concentration (1 µM) to suppress non-specific neuronal excitation in downstream assays.
- Practical limitations include the need for rapid processing post-dissection to prevent activity loss and the requirement for validation via S35 methionine incorporation or western blot to confirm synaptic enrichment.
