طريقة تفاعل الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي الريبي (RNA) بين الحمض النووي والحمض النووي

طورنا طريقة تفاعل الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي (RNA)، أو طريقة RDD، لرسم خريطة اتصال الكروماتين المنظم بواسطة جزيئات RNA محددة. يقوم RDD برسم خريطة قوية لشريط الكروماتين الخاص بالRNA والتفاعل طويل المدى بين الحمض النووي الريبي الداخلي والخارجي. للبدء، أعد تعليق الحبيبات النووية المنفذة المشتقة من خلايا ذبابة الفاكهة S2 مزدوجة الربط في 15 ملليلتر من محلول تحلل 0.1٪ FA يحتوي على Triton X-100.

أليكوت 1.5 ملليلتر من التعليق النووي في أنبوب اختبار دائري قاع بسعة 14 ملليتر مع تجنب تكون الفقاعات. قم بضبط نظام التعليق بسعة 38٪ لمدة 4.5 دقائق باستخدام دورات تشغيل وإيقاف 30 ثانية. اجمع الكروماتين الصوتي في أنبوب وجهاز طرد مركزي بسعة 15 ملليتر بوزن 3,200 جرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

نقل حوالي 13 ملليلتر من المادة الفائقة إلى أنبوب جديد بسعة 15 ملليتر. الآن، أضف 100 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين C1 المحضرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكروماتين الصوتي وقم بتدوير لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وانقل المادة الفائقة التي تحتوي على الكروماتين المنظف مسبقا إلى أنبوب جديد بسعة 50 ملليتر.

خزن 10 ميكرولتر على درجة حرارة ناقص 20 درجة مئوية للتحليل. حضن 26 ملليتر من محلول التهجين الجاهز حديثا مع 13 ملليتر من الكروماتين المنظف مسبقا على جهاز دوار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتقسيم خليط التهجين إلى ثلاثة أنابيب بسعة 15 ملليتر، وإضافة ستة ميكرولترات من المجسات البيوتينيلية بسعة 100 ميكرومولر إلى كل عينة.

بعد إغلاق أغطية الأنابيب بالفيلم، قم بتدوير الأنابيب عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد حجب خرزات الستربتافيدين C1، قم بإزالة حاجز الحظر وأعد تعليق الخرزات في 400 ميكرولتر من مخزن التهجين. الآن، أضف خرزات الستربتافيدين C1 المعالجة بالحواجز بالحاجز إلى الكروماتين الهجين المقابل الذي تم تحضيره سابقا.

قم بتدوير الخليط لمدة ساعتين ونصف على درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الفائقة ونقل الخرزات إلى أنبوب بسعة 1.5 ملليلتر، اغسل الخرزات خمس مرات باستخدام 800 ميكرولتر من محلول الغسيل ثم مرتين باستخدام مخزن TE. بعد الغسل النهائي، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخرزات في 1,000 ميكرولتر من مخزن TE يحتوي على مثبط بروتيز 1X في درجة حرارة الغرفة.

لحجب المواقع غير المشغولة على حبات الستربتافيدين C1 المرتبطة بمركب المسبار-الكروماتين، أضف 220 ميكرولتر من IPB المغير إلى الخرزات وقم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة، اغسل خرزات الستربتافيدين C1 خمس مرات باستخدام مخزن TE. بعد ذلك، أضف 693 ميكرولتر من خليط إصلاح الأطراف إلى الكروماتين على حبات ستربتافيدين C1 وامزج جيدا.

ثم أضف سبعة ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي T4. حضن الخليط على خلاط حراري بسرعة 800 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة 12 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم حضن العينة على خلط على درجة حرارة 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من مخزن ChIA-PET البارد المثلج، ثم مرة واحدة باستخدام مخزن TE. ثم أضف 693 ميكرولتر من خليط الذيل A إلى الكروماتين على حبات الستربتافيدين C1 وامزج جيدا. بعد ذلك، أضف سبعة ميكرولتر من شظية كلينو من ثلاثة أولية إلى خمسة إكسونوكيازات أولية ناقص المجموعة.

حضن الأنبوب على الخلاط بسرعة 12 دورة في الدقيقة و37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من محلول ChIA-PET البارد المثلج، ثم مرة واحدة باستخدام محلول الإزالة باستخدام الماصات اللطيفة. الآن، أضف 1,390 ميكرولتر من خليط ربط القرب إلى الكرومتين على حبات ستريبتافيدين C1، وحضن على الخلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أضف 10 ميكرولترات من ليغاز الحمض النووي T4 إلى الخليط وحضن الدوران بسرعة 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، ثم انتقل إلى 12 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 50 دقيقة واستمر في الحضانة عند 16 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من مخزن ChIA-PET البارد مثلج، ثم مرتين باستخدام مخزن TE. لإطلاق الكروماتين، أضف 480 ميكرولتر من مخزن الفضول LC ChIP إلى الكروماتين على حبات ستربتافيدين C1 وامزج جيدا.

أضف 20 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل ملليلتر من بروتيناز K لإزالة الربط المتبادل. حضن الأنبوب على خلاط حراري بسرعة 950 دورة في الدقيقة و65 درجة مئوية خلال الليل، ثم نقي الحمض النووي المرتبط بالاقتراب باستخدام كاشف كحول الفينول:الكلوروفورم:إيزوأميل. أضف جميع المكونات المطلوبة لاختبار الوسم Tn5 بحجم تفاعل إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر في أنبوب PCR على الثلج.

حضن تفاعل الوسم عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جهاز التسخين الحراري مع ضبط الغطاء على 70 درجة مئوية، ثم حافظ على 4 درجات مئوية. أضف 50 ميكرولتر من مخزن إخلاء ChIP وميكرولتر واحد من البروتيناز K إلى الحمض النووي الموسوم. اخلط المحلول وحضنه على خلاط حراري عند 65 درجة مئوية و900 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي، وقياس كمية الحمض النووي باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الشعري التلقائي. أضف كل الحمض النووي المرتبط المجزأ إلى خرزات M280 المسبقة مسبقا باستخدام حاجز العزل والحمض النووي الجيني، وامزج التعليق. قم بتدوير الأنبوب على الخلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

بعد دوران قصير، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وتخلص من السوبرناتانت. بعد خطوات الغسيل، أضف 30 ميكرولتر من محلول الإزالة إلى الخرزات دون خلط. جهز خليط PCR وفقا لمجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي.

انقل أنابيب PCR إلى جهاز PCR وقم بإعداد برنامج التضخيم. وأخيرا، بعد تنقية منتج PCR باستخدام خرزات مغناطيسية، قم بقياس 10 إلى 30 نانوجرام من حمض المكتبة النووي باستخدام مقياس حمض نووي لتحضير العينة للتتابع. تراوحت شظايا الكروماتين الصوتية بين حوالي 1,000 إلى 3,000 زوج قاعدة، مما يشير إلى نجاح التجزئة.

أظهر الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي نطاقا في حجم الشظايا يتراوح بين حوالي 1,000 إلى 3,000 زوج قاعدة. أظهر الكروماتين الموسوم ب Tn5 توزيع شظايا يدل على كفاءة وسم الكروماتين. أظهرت مكتبة التسلسل بعد التضخيم توزيعا لحجم الشظايا يتراوح بين حوالي 180 إلى 1,000 زوج قاعدة.

بعد اختيار الحجم، تم إثراء شظايا مكتبة التسلسل بشكل رئيسي في نطاق يقارب 250 إلى 600 زوج قاعدة. تفاعل الكروماتين المرتبط بالحمض النووي الريبي الريبي، أو طريقة RDD، اكتشف المواقع الجينومية لارتباط NC RNA roX2 و7SK، إلى جانب حلقات التفاعل البعيدة مع الكروماتين. تكشف بيانات بوليميراز RNA II ChIA-PET عن علاقة تنظيمية واضحة بين هذه الرينا NC والتعبير الجيني، مع ذروات تشير إلى قوة التفاعل.

تم تحقيق التحليل متعدد الأبعاد من خلال دمج التفاعلات المرتبطة ب RDD مع خرائط تكوين الكروماتين على مستوى جينوم Hi-C والعلامات فوق الجينية، والنسخ الناشئ، وبيانات بوليميراز RNA II ChIA-PET. في هذه المناطق، تم تصور المجالات المرتبطة طوبولوجيا بوضوح، حيث غالبا ما تقع حلقات الكروماتين الموجهة بالحمض النووي الريبي عند حدودها أو تمتد عبر عدة مجالات من هذا النوع. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد المراكز التنظيمية التي تركز على RNA.

طريقة RDD وتفاعلات الكروماتين المثبتة كشفت عن مواقع ارتباط الحمض النووي الريبي والتفاعلات المرتبطة به بين الحمض النووي والحمض النووي في تنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد. التعاليم الرئيسية هي الحفاظ على نسب البروب، والرابط، والكروماتين الصحيحة، وحجب مواقع الستربتافيدين غير المحدودة باستخدام البيوتين الطبيعي قبل ربط البوليميراز. يمكن للدراسات المستقبلية أن تستكشف كيف يقوم الحمض النووي الريبي بتفاعلات الكروماتين ديناميكيا عبر التطور، والاضطرابات، والعدوى.