التوليد والتحليل النصي الأحادي الخلية لعضويات سرطان الخلايا الكبدية بعد العلاج الدوائي
مايو 26, 2026
يوضح هذا البروتوكول طريقة مبسطة لتوليد عضويات سرطان الخلايا الكبدية، وتطبيق العلاج الدوائي، وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قبل وبعد العلاج لتوصيف التغيرات النساخة المرتبطة بالعلاج.
نركز على كيفية استجابة عضويات HCC لعلاج المخدرات وكيف تتغير دراساتها الترجمية في العمل. هذا البروتوكول مفيد للعضويات HCC، ويمكن أيضا تكييفه مع أنظمة أورام عضوية أخرى. للبدء، قم بتحديد سرطان الخلايا الكبدية أو العضويات المشتقة من مرضى HCC، وإعدادها للاضطرابات العلاجية.
حضر محلول لينفاتينيب في ثنائي ميثيل كبريكسيد أو DMSO، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتخفيف محلول المخزن في وسط الزراعة قبل التسخين مباشرة إلى تركيز العمل المحدد مسبقا. جهز كمية كافية من المحلول لتحقيق نفس الأحجام النهائية في جميع الآبار، مع ضمان نفس تركيز DMSO عبر كل بئر.
بعد ذلك، أضف وسط يحتوي على اللينفاتينيب بعمق 20 ميكرومولار على طول جدار كل بئر لتجنب إزعاج القباب المصفوفة. أضف وحدة تحكم في المركبة بنفس تركيز DMSO النهائي. حضن الأعضاء تحت ظروف الزراعة القياسية لفترة العلاج المحددة مسبقا.
للعلاجات التي تتجاوز 72 ساعة، استبدل الوسط الذي يحتوي على الدواء كل 48 إلى 72 ساعة، لضمان جدول استبدال منتظم في جميع الآبار. سجل صور المجال الساطع الأساسية قبل العلاج. التقاط الصور بفواصل زمنية محددة أثناء العلاج باستخدام إعدادات المجهر المتطابقة، والتكبير، ومواقع الحقل المتطابقة.
لتقييم استجابة العلاج بناء على الشكل الظاهري، استخدم إعدادات التعريض المتطابقة، والتكبير، وعتبات التحليل لجميع الصور. قس منحنى نمو مساحة العضوية بحساب إجمالي مساحة العضوية لكل بئر أو حقل في كل نقطة زمنية، وتطبيع القيم إلى الأساس الأساسي. لقياس متوسط قطر العضويات، حدد قطر الأعضاء السليمة الفردية وحساب القيمة المتوسطة لكل بئر.
بعد ذلك، حدد عدد الأعضاء الباقية عن طريق عد الأعضاء العضوية السليمة القابلة للتعرف عليها شكليا، مع استبعاد أي حطام أو شظايا منهارة. قم بإجراء اختبار قابلية الحيوية ثلاثية الأبعاد للتوهج عند نقطة المعالجة إذا كان هناك حاجة لتقييم إضافي لفعالية الكتلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم رسم منحنيات نمو مساحة العضوية مع مرور الوقت.
قارن متوسط قطر العضوية بين المجموعتين المعالجتين بالمركبات والمجموعات المعالجة باللينفاتينيب. أيضا، قارن أعداد الأعضاء العضوية الناجية عبر مجموعات العلاج. تأكد من استخدام جداول تصوير متسقة، ومعايير الشمول، ومعايير التحليل لضمان قابلية التكرار.
اختر آبار عضوية ذات شكل ثلاثي الأبعاد سليمة، ومواد كافية لالتقاط خلية واحدة، وبدون تلوث مرئي. سجل صور الحقل الساطع لكل اختيار قبل التفكك باستخدام إعدادات المجهر المتطابقة، والتكبير، ومعايير اختيار الحقل. جمع الأعضاء في نقاط زمنية مطابقة عبر مجموعات الضابطة والمعالجة، مع الحفاظ على كثافة الطلاء وجدول المعالجة وظروف استبدال الوسط عبر جميع العينات.
استنشق وسيط الثقافة بالكامل من كل بئر. اغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS البارد جدا لإزالة الوسط المتبقي والحطام. أضف ملليتر واحد من محلول استعادة الخلايا البارد المثلج إلى كل بئر، وحضن على الثلج لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
يتم وضع المصفوفات بلطف كل خمس إلى سبع دقائق أثناء الحضانة لتسهيل ذوبان المصفوفة. انقل المادة المذابة إلى أنابيب مبردة مسبقا باستخدام رأس ماصة عريض أو مقطوع لتقليل الإجهاد الظاهر. الانتقال إلى التفكك الإنزيمي فقط بعد أن تذوب المصفوفة إلى حد كبير ويبقى بقايا هلامية مرئية قليلة.
قم بالطرد المركزي لنظام التعليق العضوي المستعاد عند 300 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أزل السوبرناتينت بعناية دون إزعاج الحبيبة. أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف، وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى عشر دقائق.
قم بعمل بيبيت بلطف من ثماني إلى عشر مرات كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق، باستخدام رأس عريض P1000 لتعزيز الانفصال. أوقف الهضم عندما تتفرق معظم شظايا الأعضاء في خلايا واحدة، ولا تبقى سوى مجموعات صغيرة متبقية. بعد ذلك، أضف أربعة ملليلتر من مصل PBS البارد المثلج الذي يحتوي على 2٪ من مصل البقر الجيني لإيقاف الهضم.
ثم قم بتصفية التعليق عبر مصفاة خلوية بحجم 40 ميكرومتر. اغسله مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة الإنزيم المتبقي والرسوميات والحطام. عد الخلايا باستخدام استبعاد الأزرق التريباني.
بعد التأكد من صلاحية الخلية بنسبة 85٪ أو أكثر، قم بضبط التركيز النهائي للخلية إلى 700 إلى 1,200 خلية لكل ميكرولتر. استبعد العينات التي تحتوي على حطام مفرط، أو كثرة الخلايا الميتة، أو تجمعات كبيرة مرئية، أو تفكك غير كامل. كرر الترشيح قبل التحميل إذا كانت هناك تجمعات.
التحكم في العملية والعينات المعالجة تحت ظروف متطابقة، بما في ذلك إنزيم التفكك، وقت الهضم، تكرار التوصيل بالماصات، طريقة الترشيح، تركيز الخلية، واستراتيجية التحميل. وأخيرا، بعد تضخيم مكتبة خلية واحدة، قم بإجراء تسلسل خلية واحدة. نجا الأورغانويد وتوسع تحت ظروف الزراعة ثلاثية الأبعاد القياسية من اليوم الأول حتى اليوم السادس بعد التعافي.
في اليوم الأول، ظهرت العضويات كهياكل صغيرة ومضغوطة، بينما بحلول اليوم السادس، أظهرت حجما أكبر وشكل محدد جيدا. كانت العضويات المعالجة باللينفاتينيب أصغر، وأظهرت تغييرا في الشكل مقارنة بالمجموعة المعالجة ب DMSO. أظهر التحليل الكمي انخفاضا في متوسط قطر العضويات بعد علاج اللينفاتينيب، مقارنة بضوابط DMSO.
يتيح لنا هذا البروتوكول دراسة التغيرات في حالة الخلية، وتركيب الخلية، والتعبير الجيني بعد العلاج. أكبر تحد هو الحفاظ على بقاء الخلية، مع الحفاظ على المعالجة البسيطة المتسقة عبر جميع المجموعات. يمكن إجراء تحليل الخلايا اللاحقة باتباع هذا الإجراء، بما في ذلك التجميع، وتحليل تجارب الجينات التفاضلية، وتحليل إثراء المسارات، واستدلال الخزانة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This article presents a standardized workflow for generating hepatocellular carcinoma (HCC) organoids, applying drug treatment, and performing single-cell RNA sequencing to analyze transcriptional changes before and after treatment. The protocol is robust, scalable, and adaptable to other tumor organoid systems, enabling detailed characterization of cellular composition and gene expression changes associated with drug exposure.
Key Study Components
Area of Science
- Cancer biology
- Organoid technology
- Single-cell transcriptomics
Background
- Hepatocellular carcinoma is a leading cause of cancer-related deaths worldwide.
- Marked intratumoral heterogeneity in HCC contributes to variable treatment responses and disease progression.
- Understanding transcriptional changes in tumor cells before and after drug treatment is critical for improving therapies.
- Existing workflows connecting organoid-based drug treatment with single-cell transcriptomic profiling are limited.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for drug treatment and single-cell RNA sequencing of HCC organoids.
- To enable side-by-side comparison of cellular and transcriptional changes in response to therapy.
- To provide technical guidance for improving reproducibility and sample quality in organoid studies.
Methods Used
- Establishment and expansion of HCC patient-derived organoids.
- Drug treatment with lenvatinib and vehicle control under standardized conditions.
- Imaging and quantitative assessment of organoid morphology, area, diameter, and viability.
- Single-cell dissociation, viability assessment, and preparation for single-cell RNA sequencing.
- Comparative analysis of single-cell transcriptomic data, including clustering and pathway enrichment.
Main Results
- Lenvatinib-treated organoids showed reduced size and altered morphology compared to controls.
- Quantitative analysis revealed a decrease in mean organoid diameter after drug treatment.
- The protocol preserved high cell viability and reproducibility across samples.
- Single-cell RNA sequencing enabled detailed analysis of cell state, composition, and gene expression changes post-treatment.
Conclusions
- The workflow provides a practical and scalable approach for studying drug responses in HCC organoids at single-cell resolution.
- It facilitates robust comparative analysis of transcriptional changes associated with therapy.
- The protocol is adaptable to other organoid systems and supports downstream cellular analyses.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of hepatocellular carcinoma (HCC) organoids before and after drug treatment addresses the challenge of intratumoral heterogeneity and variable therapeutic response. This workflow enables high-resolution analysis of cellular and transcriptional changes, supporting predictive confidence in early-stage oncology discovery. The protocol's scalability and adaptability position it as a reusable platform for portfolio-wide mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing drug-induced transcriptional shifts at single-cell resolution.
- Supports biological de-risking through detailed mapping of cell state and composition changes post-treatment.
- Facilitates functional target validation by linking drug exposure to specific gene expression alterations.
- Provides predictive confidence for triaging candidate compounds based on mechanistic response profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid systems for downstream screening and quantitative assessment of drug effects.
- Standardizes imaging, viability, and morphological metrics to ensure reproducibility and assay reliability.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of compound efficacy using robust, quantitative outputs.
- Supports platform reuse across different tumor organoid models for broader screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response data with disease-relevant cellular heterogeneity observed in patient tumors.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative transcriptomic analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing pathway-level and cell-type-specific drug effects.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker identification and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging drug perturbation studies with high-content single-cell analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping drug-induced gene expression changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in organoid models.
- Analytics: Enables clustering, differential expression, and pathway enrichment analyses to compare treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular diversity and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for repeated use across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for organoid-based analytics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on high-content data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, single-cell dissociation, and transcriptomic library preparation.
- Demands access to advanced imaging, cell viability assessment, and single-cell sequencing infrastructure.
- Necessitates strict cross-team standardization of imaging, dissociation, and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable across different tumor organoid systems with attention to model-specific dissociation and viability challenges.
- Sample quality and cell viability are critical limitations that must be managed throughout processing.
