التصور والقياس لتزاوج قواعد الحمض النووي الريبي بين الجزيئات في مجموعات RNA في المختبر باستخدام مراسلي RNA مقسمين للبروكلي
مايو 29, 2026
يصف هذا البروتوكول اختبارا بصريا باستخدام مراسلي RNA مقسمين للبروكلي لاكتشاف وقياس اقتران القواعد بين الجزيئات في مجموعات RNA في المختبر.
نطبق اختبار تقرير RNA المنقسم للبروكلي للكشف وقياس اقتران القواعد بين الجزيئات في مجموعات RNA في المختبر. تشير المحاكاة الكيميائية إلى تفاعلات RNA لكنها لا تستطيع قياسها مباشرة. يتيح هذا البروتوكول التقييم المباشر والدقيق داخل مجموعات RNA.
بعد تحضير قوالب الحمض النووي لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر، امسح سطح العمل، ورفوف الأنابيب، والماصات بمحلول إزالة التلوث بالريبونوكلياز. استخدم أطراف مصفاة خالية من الريبونوكلياز لجميع خطوات التوجيه. إذابة محلول التفاعل والمحاليل النيوكليوتيدية المرفقة مع مجموعة النسخ مع يوريدين ثلاثي الفوسفات سيانين 5، أو UTP-Cy5، على الثلج.
قم بجهاز الطرد المركزي لجميع الأنابيب على 2,000 جرام لمدة ثانيتين قبل الاستخدام. ثم احسب عدد قواعد الثايمين في الحمض النووي. تحديد الأحجام المطلوبة من UTP و UTP-Cy5 لتفاعل نسخ بحجم 20 ميكرولتر مع الحفاظ على كثافة وسم متسقة عبر أنواع RNA.
بعد ذلك، حضر تفاعل نسخ بسعة 20 ميكرولتر عن طريق دمج الكواشف المعروضة. اخلط جيدا عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا واستخدام الطرد المركزي بقوة 2,000 جرام لمدة ثانيتين. بعد حضنة التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات، أضف ميكرولتر واحد من ديوكسي ريبونوكلياز المرفق مع المجموعة، وامزجه جيدا عن طريق التنبيه، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى.
ثم حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية. انقل التفاعل إلى أنبوب بسعة 1.5 مليليتر. أضف 115 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز و15 ميكرولتر من محلول توقف أسيتات الأمونيوم المرفق مع الطقم.
بعد الخلط، قم بعمل الطرد المركزي للمحلول عند 2,000 جرام لمدة ثانيتين. بعد ذلك، أضف 150 ميكرولتر من كلوروفورم الفينول إلى الأنبوب وامزجه بلطف لدمج الأطوار. الطرد المركزي عند 16,000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم نقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد. أضف كمية متساوية من الكلوروفورم إلى المحلول المنقول وامزج جيدا لضمان تفاعل الطور المناسب. الآن قم بالطرد المركزي عند 16,000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية وكرر عملية فصل الطور مرة أخرى.
ثم نقل الطبقة المائية التي تتراوح حوالي 100 إلى 150 ميكرولتر إلى أنبوب جديد. أضف 900 ميكرولتر من الأيزوبروبانول وامزج جيدا. بعد جمع المحلول في أنابيب منفصلة، خزن العينات عند ناقص 20 درجة مئوية طوال الليل أو حتى شهر.
قم بطرد الريبي العينة بالريد الريبي في إيزوبروبانول عند 16,000 جرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة الأيزوبروبانول بعناية دون الإخلال بحبيبات RNA. ثم أضف ملليتر واحد من الإيثانول 70٪ معد في ماء خال من النوكلياز إلى الحبيبة.
الطرد المركزي عند 16,000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة الإيثانول، أضف ملليتر واحد من الإيثانول بنسبة 70٪ محضر في ماء خال من النوكلياز إلى الأنبوب وكرر عملية الطرد المركزي. خلال الغسل النهائي بالإيثانول، قم بإزالة معظم الإيثانول باستخدام ماصة بسعة 1,000 ميكرولتر.
قم بغسل الطرد المركزي لفترة وجيزة بوزن 2,000 جرام لمدة ثانيتين في جهاز طرد مركزي صغير على طاولة وإزالة أي إيثانول متبقي باستخدام ماصة بسعة 20 ميكرولتر. بمجرد تجفيف حبيبة RNA، أعد تعليقها في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. احتفظ بالعينة على الثلج وحمها من الضوء.
باستخدام مطياف الفوتوفوتومتر الميكرو، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء. تأكد من أن نسبة الامتصاص عند 260 على 280 نانومتر تكون تقريبا 2.0، وأن نسبة الامتصاص عند 260 على 230 نانومتر أكبر من 2.0. قم بإذابة أنبوب يحتوي على محلول سبيرمين بسعة 100 ملم مولر و50٪ بولي إيثيلين جليكول 8,000 على الثلج.
جهز مخزن إعادة طي 10X RNA بدمج المكونات المعروضة. بعد خلط المكونات جيدا عن طريق التوصيل بالماصات، استخدم الطرد المركزي بوزن 2,000 جرام لمدة ثانيتين في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. في حالة الطي المشترك، في أنبوب PCR بسعة 200 ميكرولتر، اجمع RNA منسوخ في المختبر الذي يحمل إما التسلسل العلوي أو السفلي، ومخزن إعادة طي RNA، وماء خال من النوكليز.
اخلط جيدا عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا باستخدام الطرد المركزي كما أوضح سابقا. سخن العينة على درجة حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين. انقل العينة فورا إلى درجة حرارة الغرفة.
احمها من الضوء وحضن لمدة ساعة. لحالة الطي المنفصلة، قم بتسخين عينة RNA في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر ثم وضعها فورا على الثلج لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. في أنبوب PCR بسعة 200 ميكرولتر، اجمع بين RNA منسوخ في المختبر يحمل تسلسلا علويا أو سفليا، و10 مرات RNA لإعادة طي الخادم، وماء خال من النوكليز.
حضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، محميا من الضوء. الآن اجمع عينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على التسلسلات العليا والأسفلية في أنبوب PCR واحد وامزج جيدا عن طريق التوصيل بالماصات للأعلى والأسفل. الطرد المركزي على وزن 2,000 جرام لمدة ثانيتين في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.
حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لكلتا الحالتين، أضف ستة ميكرولترات من خليط واحد إلى اثنين من سبيرمين 100 ملليمولر و50٪ بولي إيثيلين جلايكول 8,000. بعد خلط المحتوى، استخدم الطرد المركزي على 2,000 جرام لمدة ثانيتين في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة.
الآن اخلط ميكرولترين من DFHBI-1T بملليمولر واحد مع التفاعل والطرد المركزي مرة أخرى. حمل التفاعل في زجاج غطاء زجاجي بغرفة. حضن الحجرة في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات في الظلام مع وضع الغطاء لتقليل التبخر.
قم بتحميل زجاج الغطاء الزجاجي على مرحلة المجهر. شغل الليزر، ثم استخدم العينات لتحديد العينة والتركيز عليها. قم بتكوين المجهر لتصوير كل منطقة محل اهتمام باستخدام قنوات السيانين الخمس أولا عند كل مستوى Z.
ثم قم بتصوير نفس المنطقة المعنية باستخدام قناة البروتين الفلورية الخضراء. اضبط وقت التعريض إلى 500 مللي ثانية لجميع القنوات. ثم اضبط طاقة الليزر على 80٪ لقناة البروتين الفلوري الأخضر و40٪ لقناة السيانين 5.
باستخدام حجم خطوة Z يبلغ 150 نانومتر، صور منطقة انزلاق غطاء خارج قطرة التفاعل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بقياس الاقتران القاعدي بين الجزيئات باستخدام برنامج تحليل الصور. عند تحفيز تجمع الحمض النووي الريبي، تشكل كلا الرنا تجمعات إما بشكل فردي أو معا.
كان فلورة DFHBI-1T داخل عناقيد الحمض النووي الريبي أقل بكثير للحمض النووي الريبي العلوي أو السفلي فقط مقارنة بحالة الطي المشترك. في حالة الطي المنفصل، كانت إشارة DFHBI-1T المعتدلة 0.031، وهي مماثلة للمستويات الأساسية التي لوحظت في الأعلى أو الأسفل فقط. أظهرت شوا-توب، شو-بوتوم، شو-مضاد-توب، وشوا-أنتي-بوتوم بشكل فردي فلورة DFHBI-1T قليلة.
الطي المشترك بين الشو-توب مع شو-بوتوم أو شو-مضاد-التوب مع شو-مضاد-القاع ينتج إشارة DFHBI-1T أعلى من الطي المنفصل. أدى الطي المشترك بين شو-توب وشو-بوتوم إلى زيادة 5.63 طية في فلورة DFHBI-1T الطبيعية. أظهر الطي المنفصل بين الشو-توب والشو-بوتوم زيادة بمقدار 1.04 طائر فقط مماثلة للمستويات الأساسية.
أظهر الشو-توب الممزوج مع شو-مضاد للقاع وشو-مضاد للقمة ممزوج بشو-بوم فلورة DFHBI-1T أعلى من أزواج نفس الاتجاه تحت كلا الظرفي للطي. أدى طي شو-توب مع شو-مضاد للقاع وشو-مضاد للتوب مع شو-بوم إلى زيادة 61.86 و82.60 طعفا في فلورة DFHBI-1T على التوالي. أدى الطي المنفصل لهذه الأزواج المختلطة إلى زيادات أصغر بمقدار 2.69 و4.94 ضعف على التوالي.
أهم اعتبار هو أن توليد الإشارة المتينة قد يتطلب مواد تجمع بينما تعتمد الحساسية على التمثيل الفعال وطي RNA البروكلي المنقسم. يكمل هذا الاختبار طرق سحب الحمض النووي الريبي للأسفل والهلام الكهربائي لدراسة اقتران القواعد بين الجزيئات في عناقيد الحمض النووي الريبي. يمكن لهذا الاختبار فحص تأثيرات تسلسلات الحمض النووي الريبي، والهيليكازات، والأيونات على اقتران القواعد بين الجزيئات داخل عناقيد الحمض النووي الريبي.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
