无菌技术在环境科学中

无菌技术是微生物学的一项基本技能，在环境研究中具有重要的应用。

如果微生物培养物受到污染，实验室"清理"或更换培养物所需的时间、劳动力和财务成本，特别是来自独特环境中的稀有分离物，可能非常高且令人望而却步，并且某些样品可能是不可替代的。

正确使用无菌技术可降低试剂、培养基和环境样品受到细菌和真菌污染的可能性，并避免样品之间的交叉污染。它也是一种安全措施，可以减少微生物向实验者的潜在传播，这在处理病原体时尤为重要。

本视频将介绍无菌的原理;维持无菌试剂和培养物的几种重要技术;最后，它们在环境科学中的一些用途。

使用无菌技术的目标是创造和维护无菌的工作环境、设备和试剂，以最大限度地减少生物样品的污染。常见的污染源包括空气中的微生物、实验室工作台或设备上存在的微生物，以及研究人员的头发、身体和衣服上的微生物。

在实验室中，两种试剂对于去除或防止污染至关重要：消毒剂、化学品和加热剂。在进行无菌工作之前，通常使用 70% 乙醇和稀漂白剂等溶液对设备、工作表面和实验人员的手套进行消毒。

同时，工具、玻璃器皿和液体介质上或内部的微生物可以在高压灭菌器中被加热除死，高压灭菌器是一个通过暴露于高温加压蒸汽对内容物进行消毒的腔室。此外，用于扩散电镀和金属孕育环等工具可以使用火焰源（如本生灯）进行热消毒。

使用火焰源也是建立无菌工作环境的最常用方法之一。火焰产生的热量引起空气对流，产生上升气流，将任何空气中的污染物从燃烧器附近吹走，并形成一个"无菌场"，用于进行无菌实验工作。

现在您已经了解了无菌技术背后的原理及其重要性，让我们来了解一下创建无菌工作环境、构成无菌生长培养基以及在不同培养条件之间无菌转移细菌的方案。

在开始无菌工作之前，实验人员必须穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。这样做的目的是防止实验者污染样品和实验室培养物，同时也是为了防止潜在致病微生物转移给研究人员。个人防护装备物品包括实验服、手套和安全护目镜。

下一步是正确消毒和储存用于培养微生物样品的生长培养基。首先，称取适量的固体培养基组分，在可高压灭菌的容器中加入制造商指定的适当体积的液体溶剂（如去离子水）加入磁力搅拌棒，将容器放在热板搅拌器上，用小火和搅拌溶解固体培养基组分。

关闭中型容器。如果使用带有旋入式盖的玻璃容器，请确保不要完全拧紧盖子，因为容器内的空气会因高压灭菌过程中的加热而膨胀，需要逸出。如果不逸出，气体可能会导致血管破裂。在容器上放一条高压灭菌带，并根据制造商的说明对介质进行高压灭菌，例如在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。高压灭菌后，验证高压灭菌带上的条纹是否变黑，表明已达到适当的温度。

对于液体生长培养基，让它们冷却至室温，并在室温下或酌情冷藏储存。对于基于琼脂的固体生长培养基，让它们冷却至约 50 °C。C，然后倒入无菌培养皿中。让琼脂冷却并凝固，然后在适当的温度下储存。

对于由于存在热敏性成分而无法高压灭菌的培养基，请使用 0.22-？m 过滤器进行过滤灭菌。

微生物学工作的核心技术是在不同的生长培养基（固体和液体）之间无菌转移细菌培养物。在开始之前，用消毒剂清洁实验室工作台表面。这降低了污染培养物或无菌培养基的风险。

转移细菌培养物通常使用一种称为接种环的工具，使用前需要通过在火焰中加热对其进行消毒。

打开火焰源。慢慢地将接种环穿过火焰的尖端。循环将变为炽热的。要从固体琼脂平板转移细菌菌落，请稍微打开培养皿板，然后将热接种环轻轻敲击到琼脂表面的空白部分，以避免热杀死细菌。用接种环刮取一个菌落，然后关闭板。

要从液体生长培养基中转移细菌，请从培养容器上取下盖子。为防止污染，请避免将瓶盖放到工作台上。将容器口穿过火焰最热的部分 2-3 次。然后，小心地将热的、消毒的接种环触摸到容器内部，让它冷却，然后再将其插入肉汤培养物中。取出一环培养物，并立即盖上盖子。

要将获得的细菌转移到无菌生长培养基中，请从装有无菌肉汤的容器中取出盖子，然后将容器的开口穿过火焰 2-3 次。然后，小心地将接种环放入培养基中，轻轻搅拌以释放细菌。立即合上盖子。使用后对接种环进行消毒。

如果将细菌转移到无菌琼脂平板上，请打开装有未接种琼脂的新鲜培养皿的盖子。用细菌培养物在琼脂的一个扇区来回划线接种环。对环进行消毒并通过触摸琼脂的空白部分来冷却它，然后在琼脂上以与第一条条纹成钝角再划一条，确保在前 1-2 次冲程中穿过第一条条纹，但避免在后续冲程中接触第一条条纹。重复消毒并再划线 2 次。关闭培养皿，并对接种环进行消毒。

接种后，肉汤或琼脂板应在给定微生物的理想生长温度下孵育，以获得活的培养物。在固体培养基上，在前两条条纹覆盖的琼脂上可以看到草坪或连续的细菌链，但应在最后一条条纹上获得单个菌落。不良的无菌技术会导致印版上生长霉菌和其他污染物。

无菌技术在许多涉及环境微生物样品的实验中非常重要。在这项研究中，研究人员从常见的土壤细菌节杆菌中分离出噬菌体，这是一种感染细菌的病毒。节杆菌培养物首先在无菌条件下生长。然后用噬菌体缓冲液洗涤和过滤土壤样品，将噬菌体溶液与细菌培养物混合并接种到琼脂平板上。盘子上会形成细菌草坪，但在病毒感染并杀死细菌的地方会有空地或"斑块"。然后可以从这些噬菌斑中纯化噬菌体以供进一步研究。

除了使用本生灯外，还可以在称为层流罩的专用工作站中维持无菌工作环境，该工作站使用定向气流和过滤器来保持无菌。在这里，科学家们在流动罩中工作，从水样中分离出潜在的致病细菌和病毒。然后将这些分离株与变形虫一起培养。因为变形虫通常吃掉或"吞噬"细菌，所以任何能够抵抗变形虫消化并留在这些生物体中的细菌也有可能在人体细胞中保持活力并引起疾病。

最后，无菌条件允许详细研究生态机制，例如豆科植物根瘤的形成 - 充满细菌的器官将大气中的氮"固定"成氨，供植物用于生长。这里的研究人员创建了"微观世界"，用于研究带缺口的培养皿和植物生长培养基，将幼苗放入其中，并用形成结瘤的根瘤菌接种幼苗。流动罩的无菌环境可防止培养物被其他细菌或真菌污染。

您刚刚观看了 JoVE 关于环境科学中无菌技术的视频。您现在应该了解为什么无菌工作条件很重要;如何无菌进行微生物实验;以及无菌技术在环境研究中的一些应用。一如既往，感谢您的观看！