革兰氏染色的细菌环境来源

革兰氏染色可快速观察细菌形态和从各种环境样品中的广泛细胞区分。为了给细菌染色，将均匀的涂抹物涂在玻璃面上并晾干。对涂片进行热固定后，涂上结晶紫。

脱色剂可冲洗掉革兰氏阴性细胞中的结晶紫，但不会冲洗掉革兰氏阳性细胞中的结晶紫。第二种染料（通常是番红）用作背景染色剂，以观察革兰氏阴性细胞。染色后，可以评估细胞的形态、大小和排列，例如链或簇。

该视频将演示如何制备环境样品，分离其中发现的细菌种类，并对分离的菌落进行革兰氏染色

革兰氏染色可以将大多数细菌分为两大类结构类别：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。虽然这两类都有潜在的磷脂质膜，但细胞壁的结构差异很大。革兰氏阳性细胞壁主要由一层厚厚的肽聚糖组成，肽聚糖是一种由糖和氨基酸组成的聚合物。革兰氏阴性细胞壁具有较薄的肽聚糖层，夹在第二层脂质膜之间。该外膜通常含有脂多糖。

带正电荷的结晶紫与带负电荷的细菌细胞壁结合较弱。革兰氏碘与结晶紫染料形成不溶性复合物，从而将其固定在细胞壁中。

在脱色步骤中，革兰氏阳性细胞中的肽聚糖脱水，使其收缩并捕获结晶紫碘复合物。在革兰氏阴性细胞中，脱色剂会损害外膜，增加其孔隙率。这允许洗掉结晶紫碘络合物。

现在您已经了解了革兰氏染色土壤细菌背后的原理，让我们看看在实验室中对土壤细菌进行的过程。

在田间收集土壤样本后，将其带入实验室进行分析。用筛子精制样品，并使用分析天平称取 10 g 过筛的土壤。

将样品稀释到 95 mL 磷酸盐缓冲盐水中并涡旋混合。再进行 1 至 10 次稀释，在每次稀释之间涡旋。将至少 3 次连续稀释的等分试样转移到重复的低营养琼脂糖平板上。

在乙醇火焰灭菌并通过敲击介质冷却弯曲的玻璃棒后，将样品铺在板的表面上。在室温下孵育板。孵育 3 至 5 天后，选择具有 30 至 300 个离散菌落的最高稀释度。使用无菌接种环，选择感兴趣的菌落进行分离。

将菌落划线到新板的一部分上。对条纹之间的环进行消毒，在板的每个部分上以锯齿形图案制作连续的条纹，以允许随后分离离散的单个菌落。在室温下孵育板 1 至 2 天。

开始制备细菌涂片时，将夹子连接到预先清洁的载玻片上，以便于处理。对于每个细菌涂片，清洁接种环并对其进行火焰灭菌。将 2 环无菌蒸馏水放在载玻片的中心。

再次对定量环进行消毒后，从分离的菌落中取出少量培养物，并与载玻片上的水混合。重要的是在接触培养物之前通过敲击琼脂的未接种部分数次来冷却环。涂片应类似于稀释的牛奶。让玻片在室温下干燥。干燥后，通过快速通过火焰加热固定污迹。

干燥后，用移液管将结晶紫移液到涂片上，静置 2 - 3 分钟。用蒸馏水小心冲洗载玻片，将直接水流对准载玻片顶部，让水轻轻流下。不要将水流直接对准污迹。

用 Gram 碘覆盖载玻片。2 分钟后，用蒸馏水轻轻冲洗。用 95% 乙醇对载玻片进行脱色，直到污渍不再被冲走。立即用蒸馏水冲洗。这将限制涂抹的过度脱色。

将番红作为复染剂添加到涂片中 30 秒。这将对存在的任何革兰氏阴性细胞进行染色。用蒸馏水轻轻冲洗，然后用吸水纸吸干。用显微镜观察所得载玻片。首先使用低倍物镜进行粗略调整并找到拖尾的理想部分，然后再转到较高放大倍率的较小视场。

使用中等倍率物镜进一步成像和调整涂片后，将浸油直接添加到涂片中。高功率物镜需要这种油，这将提供最好的显微照片。革兰氏阳性菌呈蓝色或紫色，而革兰氏阴性细胞呈红色或粉红色。除了细胞壁结构外，还可以从所得显微照片中阐明形状和排列。

革兰氏染色定性研究细菌的能力对广泛的科学领域都很重要。

土壤只是可以分离和分析细菌的环境来源之一。对于饮用水，必须修改样品制备。可以从水龙头中抽取自来水样品，并接种到促进各种异养细菌菌落生长的生长培养基上。铺板到 R2A 等介质上时，该过程与土壤程序几乎相同。

对于某些细菌鉴定技术，参数取决于目标细菌的细胞壁类型。在这个例子中，对一名败血症患者的血液进行了检测，发现其中含有革兰氏阳性菌。

根据这些信息，选择了将与细胞 rRNA 结合的物种特异性肽核酸探针。这些探针与用于鉴定存在的物种的荧光染料结合。

由于革兰氏阳性和阴性细胞结构的根本差异，细菌对除结晶紫以外的其他化合物具有独特的反应。该实验试图从粪便样本中分离出革兰氏阳性菌艰难梭菌。将抑制革兰氏阴性细胞生长的环丝氨酸添加到琼脂平板中。通过其他方法进一步分离在平板上生长的革兰氏阳性细胞。

您刚刚观看了 JoVE 对用于环境研究的革兰氏染色的介绍。您现在应该了解该过程的好处以及如何执行该技术和利用结果。感谢观看！