采用凝集素偶联的POROS微珠进行高效液相色谱分析。糖肽标准品用作阳性和阴性对照。将经MARS-14去除高丰度蛋白并经胰蛋白酶消化的人血浆进行色谱分离，收集流穿组分（FT）和结合组分，用于电喷雾电离液相色谱-串联质谱（ESI-LC-MS/MS）分析。与流穿组分相比，糖肽在结合组分中得到富集。
本文内容
摘要
摘要
聚糖是一类重要的翻译后修饰分子。它们通常存在于分泌蛋白和细胞外分子上，其结构可反映细胞内部状态。肿瘤细胞表面的聚糖往往富含唾液酸和岩藻糖基团。我们提出，可利用这些与癌症相关的聚糖变异形式，开发用于早期疾病诊断的生物标志物。为此，我们建立了一种基于质谱的实验流程，该流程结合了以凝集素为亲和基质的色谱技术。凝集素是一类可特异性结合特定聚糖结构的蛋白质。我们将分别识别唾液酸和岩藻糖的黑接骨木凝集素（Sambucus nigra, SNA）和橙黄伞菌凝集素（Aleuria aurantia, AAL）共价偶联至POROS微珠（Applied Biosystems），并装填于聚醚醚酮（PEEK）柱中，用于高压液相色谱（HPLC）。简言之，首先使用多重亲和去除系统（MARS-14；Agilent）去除血浆中丰度最高的十四种蛋白质。去除了高丰度蛋白的血浆样品经胰蛋白酶消化后，通过SNA或AAL HPLC分离为流穿组分和结合组分。各组分经PNGaseF处理以去除N-连接聚糖，随后在QStar Elite质谱仪上进行LC-MS/MS分析。数据采用Mascot软件进行解析。实验设计包括阳性对照——岩藻糖基化和唾液酸化的乳铁蛋白糖肽——以及阴性对照——来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的高甘露糖型糖肽，用于监测凝集素富集的特异性。该实验流程的关键特征包括：基于HPLC格式所带来的良好重复性；通过去酰胺化的Asn-Xxx-Ser/Thr序列模式对捕获并经PNGaseF处理的糖肽进行确证性鉴定；以及利用糖蛋白标准品进行质量评估。方案优化还包括确定起始样品与色谱柱容量的合适比例，筛选最有效的捕获与洗脱缓冲液，以及监控PNGaseF处理过程以确保完全去糖基化。未来的研究方向是将该流程应用于乳腺癌患者与健康对照个体血浆样本的质谱驱动发现研究。
聚糖，翻译后修饰，生物标志物，质谱，液相色谱-质谱联用，凝集素，SNA，AAL，HPLC，PNGaseF，血浆，糖蛋白，乳腺癌
方案
1) 制备凝集素偶联的 POROS 柱
- 佩戴口罩，以防在步骤 1.1 - 1.2 中吸入 POROS-AL 微球。称取所需量的 POROS 微球（每 100 mg 微球/300 μl 最终体积）并转移至洁净的微量离心管中。
- 用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠。在微量离心机中以最大速度离心3分钟，使磁珠沉淀。弃去上清液，并重复洗涤一次。
- 称取所需量的未结合凝集素（1 - 4 mg/ 200 μl 珠粒）转移至洁净的微量离心管中。加入 PBS 配制成 5–20 mg/mL 的溶液。保留备用 25 μl 该溶液的
- 将剩余的凝集素溶液转移至 POROS 小球中。加入氰基硼氢化钠至终浓度为 50 mM。将离心管置于摇床上，室温下振荡反应过夜。（注意：氰基硼氢化钠具有毒性，必须在通风橱中操作。被污染的废弃物须妥善处理。）
- 按照步骤1.2离心收集POROS珠。移除上清液，并作为偶联后溶液保存。
- 用 1 mL 淬灭缓冲液（1 M Tris-Cl，pH 7.4）洗涤磁珠。参照步骤 1.2 方法离心收集磁珠，并安全弃去上清液。
- 用1 mL 淬灭缓冲液封闭POROS珠上剩余的活性位点。加入氰基硼氢化钠至终浓度为50 mM。将离心管置于摇床上，室温孵育30分钟。
- 离心收集步骤1.2中的沉淀珠，弃去上清液。
- 用1 mL 1 M NaCl洗涤磁珠。离心收集磁珠并弃去上清液。重复此步骤四次，共洗涤五次。磁珠现可进行装柱。
- 为确定与POROS珠结合的蛋白量，需对结合前和结合后的凝集素溶液进行蛋白浓度测定。浓度之差即为结合到珠上的蛋白量。每单位体积珠所结合的蛋白量等于珠上凝集素的浓度。目标凝集素浓度范围为2–20 mg/mL。
2) 将凝集素偶联的 POROS 小珠装填至 PEEK 柱中
- 组装填充系统（具体描述见下文），并将其固定在金属环架上。填充系统自下而上依次为：压力限制器、柱端接头1、烧结片、色谱柱（2 × 50 mm）、柱端接头2、柱连接器、柱端接头3、色谱柱（4.5 × 50 mm）、柱端接头4和终端接头。上方的色谱柱用作填充材料的储液槽。
- 将POROS珠重悬于所需体积的缓冲液A（10 mM Tris缓冲液，pH 7.4，150 mM氯化钠，10 mM氯化钙，10 mM氯化镁）中。若用于装填一根色谱柱（~200 μl 床体积），重悬于 400 μl 缓冲液 A
- 将偶联的POROS凝胶转移至上层柱管（储液室）。向储液室中加入缓冲液A，直至液面升至柱床上端。轻轻将柱端接头安装到柱管顶部，注意避免柱内产生气泡。将上层柱管的接头连接至高效液相色谱（HPLC）系统。
- 用缓冲液A通过系统对色谱柱进行装填。起始流速为0.5 mL/min，每分钟增加0.5 mL/min，直至达到4 mL/min或最高压力（3000 psi）。随后在可达到的最高流速下继续冲洗，直至至少有35 mL的缓冲液A流经色谱柱。
- 关闭泵，使柱压逐渐降至 < 20 psi
- 轻轻地从顶部开始拆卸装填系统。当拆至末端柱连接头2时，需小心移除。此时应有部分填料从柱子顶端挤出。使用剃刀片或类似锋利工具，轻轻刮去突出的微珠，使微珠表面与柱子顶端齐平。操作过程中切勿对微珠施加压力。
- 将填充柱从铁架台上取下。将新的烧结板放入一个新的端部接头中，并将填充柱翻转，使新开口端（原顶部）与装有烧结板/端部接头的一端连接。
- 正确标记柱子。现在即可使用。不使用时，可将柱子保存在含0.02%叠氮化钠的PBS中 4 °C 长达6个月。
3) 编程设定高效液相色谱方法
- 您的HPLC编程细节将根据制造商软件的具体情况而有所不同。我们使用的是Michrom Paradigm MG4 HPLC。在此设备上，方法的建立和访问需通过屏幕顶部的“Setup”选项卡进行。请编程以下方法：
时间 流速（μl/min) % A % B 0:00 50 100 0 9:00 50 100 0 9:01 500 0 100 13:50 500 0 100 13:51 3000 100 0 19:50 3000 100 0
缓冲液A：10 mM Tris缓冲液，pH 7.4，150 mM氯化钠，10 mM氯化钙，10 mM氯化镁
缓冲液B：0.5 M 乙酸
紫外检测器应设置为在 0:00 至 19:50 期间于 280 nm 波长处进行检测。应调整 y 轴以检测低吸光度水平。 例如0 - 50 AU - 如果配有自动进样器，请按照以下程序设置组分收集；否则，在进行色谱分析时，根据指示手动收集各组分。
组分 样品注入后至收集的延迟时间 采集时长（分钟） 流通式 2.8 4.1 结合的 9 2.6
4) 准备高效液相色谱样品
- 在本方案使用前，应使用 MARS 柱（Agilent；Santa Clara, CA）去除人血浆中丰度最高的 14 种蛋白质。去除了高丰度蛋白的血浆、人乳铁蛋白和酵母蔗糖酶应分别进行胰蛋白酶消化并脱盐，方法如前所述1。
- 为制备凝集素特异性的乳铁蛋白标准品，采用第 3 部分所述方法，将 50 μg 胰蛋白酶消化后的乳铁蛋白分别上样至 AAL 或 SNA 柱进行层析。结合组分将含有凝集素特异性的乳铁蛋白糖肽。按照第 4.4 部分的方法中和样品，并按第 6 部分方法进行脱盐。将样品重悬于 1 mL A 缓冲液中。所得样品即可使用。
- 将进行三次实验重复。为准备三次重复的样品，向 30 μl 经 MARS 去除高丰度蛋白、胰蛋白酶消化后的血浆当量（PE）中加入 3 pmol 胰蛋白酶消化的蔗糖酶和 1 μl 凝集素特异性乳铁蛋白（AAL-LAC 或 SNA-LAC）。PE 定义为产生一定量处理后血浆（经 MARS 去除高丰度蛋白并进行胰蛋白酶消化）所对应的未处理/完整/原始血浆体积。向样品中加入 A 缓冲液，使最终体积达到 330 μl。
- 向将用于收集洗脱液的样品管中加入中和缓冲液（1 M Tris，pH 8.0）。所用管的数量和体积取决于自动进样器的限制条件。对于 Paradigm MG4 系统，一个管收集穿流液，两个管收集洗脱液。中和 1 mL 洗脱液约需 1.5 mL Tris 缓冲液。目标中和后 pH 为 7.0–8.0；使用 pH 指示试纸检测最终 pH。
5) 进行层析
- 后续所有空白对照和样品运行均采用第1部分所述方法。使用过程中色谱柱和缓冲液均保持室温。色谱柱储存于4 °C，缓冲液储存于室温。
- 将AAL或SNA凝集素柱连接至高效液相色谱（HPLC）系统，并运行两次空白方法（仅注入缓冲液A）。确保所用凝集素柱与第2部分中对应的凝集素特异性乳铁蛋白相匹配。
- 对三个血浆样品进行色谱分析，每注入一个样品之间插入一次空白运行，共完成7次HPLC运行。空白运行的组分无需收集。
6) 脱盐收集的组分
每种组分使用一个1 mL Waters Oasis HLB SPE小柱，步骤如下：
- 将所需数量的萃取柱连接至真空 manifold 上。
- 用 1 mL 含 1% 甲酸的 80% 乙腈润洗每根萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 5 - 20 lnHg）。
- 用 1.5 mL 0.1% 甲酸平衡萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 5 - 20 lnHg）。
- 将一份样品的全部体积上样至一根萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 2 - 2.5 lnHg，流速不得超过 1 mL/min）。
- 用 3 × 1 mL 0.1% 甲酸洗涤萃取柱（manifold 上的真空表读数应为 5 - 20 lnHg）。
- 用 1 × 1 mL 含 0.1% 甲酸的 80% 乙腈洗脱肽段/糖基化肽段至已标记的离心管中（manifold 上的真空表读数应为 2 - 2.5 lnHg，流速不得超过 1 mL/min）。每根萃取柱使用一个单独的收集管。
- 向每个收集管中加入 60 μl 0.5 M 碳酸氢铵以中和洗脱液。目标中和 pH 为 7.0–8.0；使用 pH 试纸检测最终 pH。
- 将洗脱的肽段/糖基化肽段在真空离心浓缩仪（例如 Thermo Savant SpeedVac）中于 35°C 下浓缩约 2 小时，至体积约为 50 μL。
7) PNGase F 消化
- 检测样品 pH，确保其在 7.0 - 8.0 之间。如有需要，加入 50 mM 碳酸氢铵以提高 pH。若最终样品体积 > 100 μl，使用真空浓缩仪将样品浓缩至 50–100 μl。
- 向每个样品管中加入 0.5 μl（250 U）无甘油 PNGase F，并在 37 °C 下孵育过夜。
8) 使用 Zip Tip 进行样品处理
- 从经PNGase F消化的样品开始，按如下步骤对每个样品进行Ziptip处理。
- 用润湿的Ziptip 10 μl 100% 乙腈，随后 10 μl 80% 乙腈，0.1% 甲酸
- 用溶液平衡移液枪尖 20 μl 0.1% 甲酸
- 通过移液枪将样品在Ziptip填料中上下移液10次，以完成样品加载。
- 用移液枪反复吹打清洗移液尖 10 μl 0.1% 甲酸，5 次。
- 用干净的离心管收集洗脱样品 10 μl 80% 乙腈，0.1% 甲酸
- 重复洗脱步骤，并加入第二次洗脱液 10 μl 加入同一管中。
- 将样品真空离心浓缩至指定体积 < 2 μl.
- 重悬样品于 20 μl 0.1% 甲酸。样品现可进行 LC-MS/MS 分析。
9）代表性结果：
POROS 偶联通常可产生每珠粒 2 - 20 mg/mL 范围内的凝集素浓度，此浓度适用于亲和层析。
胰蛋白酶消化的MARS耗竭型人血浆经凝集素色谱后，通常可在结合组分中富集糖肽。由于糖肽在LC-MS/MS分析前经过PNGase F处理，因此被鉴定为具有N-连接糖基化共识序列NXS/T（其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸）的肽段，且天冬酰胺残基在PNGase F作用下已转化为天冬氨酸。具有上述特征的肽段被视为去糖基化肽段（或“去糖肽”）。通常情况下，AAL或SNA色谱的流穿组分（FT）中约含有2-4%的去糖肽，而结合组分中回收的肽段有30-50%为去糖肽。使用QStar Elite质谱仪时，通常可在流穿组分中鉴定到1000-1300个肽段，在结合组分中鉴定到200-400个肽段。在流穿组分中应检测到两个或更多不同的转化酶去糖肽，在结合组分中应检测到两个或更多不同的乳铁蛋白去糖肽（表1）。
表 1.
讨论
本方案提供了一种以糖链特异性方式快速分离和鉴定糖肽的方法。由于糖基化修饰在生物体内存在广泛变异，尤其在发育和致病过程中，该技术可适用于解决多种科学问题。特别是，我们正在利用该方法选择性富集携带癌症相关表位修饰的糖肽，作为生物标志物发现的第一步。
致谢
本工作由癌症临床蛋白质组学技术计划资助，项目编号5U24CA126477-04。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人血浆 | 本实验室自制 | ||
| 人乳铁蛋白 | Sigma-Aldrich | L0520 | 使用前需胰蛋白酶消化 |
| 酵母转化酶 | Sigma-Aldrich | I0408 | 使用前需胰蛋白酶消化 |
| Oass HLB 固相萃取小柱 | Waters | WAT094225 | 1 cc 体积 |
| ZipTip 吸头 | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore，C18，适用于 10 µL 移液器 |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| pH 指示试纸 | Fisher Scientific | M95903 | 范围 0–14 |
| 乙腈 | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| 甲酸 | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 14190-136 | 不含钙和镁 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705L | 无甘油 |
| 真空过滤瓶 | Fisher Scientific | SCGVU05RE | 0.2 mm 孔径 |
| POROS-AL 微球 | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia 凝集素 | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra 凝集素 | Vector Laboratories | L-1300 | |
| 氰基硼氢化钠 | Sigma-Aldrich | 296945 | 5.0 M 溶液 |
参考文献
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
重印与许可
