方法文章

在单个突触前末梢通过FFN可视化多巴胺释放

DOI：

10.3791/1562

⸱

2009年8月31日

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1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种利用荧光多巴胺类似物光学测量神经传递的新方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经系统通过突触小泡融合过程中的神经递质释放，在神经元之间传递信号。为了直接观察单个突触前终末对神经递质的摄取和释放，我们设计了荧光假性神经递质作为突触小泡单胺转运体的底物。利用这些探针成像纹状体中的多巴胺释放，我们获得了若干与突触可塑性相关的发现。我们发现，每次刺激时释放神经递质的突触小泡比例依赖于刺激频率。在这些实验条件下，未观察到动力学上独立的“储备”突触小泡群体。研究揭示了突触前终末存在频率依赖性的异质性，该特性部分依赖于D2多巴胺受体，提示了一种突触前选择的频率依赖性编码机制。

Hui Zhang 和 Niko G. Gubernator 对本工作贡献相同。

方案

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本方法已用于所报告的研究中 总督 等，科学 324 (5933). 1441-1444 (2009).

1. 制备急性纹状体切片

  1. 在制备急性纹状体脑片之前，必须预先将人工脑脊液（ASCF）通氧，并用冰块将其冷却至少15分钟，然后才能进行脑组织提取。在解剖过程中，始终保持ASCF处于冰冻且持续通氧的状态。ASCF配方（单位：mM）：NaCl 125，KCl 2.5，NaHCO3 26，CaCl2 2.4，MgSO4 1.3，KH2PO4 0.3，葡萄糖 10，HEPES 5；pH 7.3–7.4，渗透压 290–295 mOsm。
  2. 对雄性小鼠实施无麻醉斩首。
  3. 从小鼠体内取出完整脑组织，并使用Krazy®Glue将其固定在振动切片机的切片托上。脑组织的取出与固定过程必须在2分钟内完成。在此期间，务必保持ASCF处于冰冻且持续通氧的状态，以维持组织活性。
  4. 在前囟（bregma）+1.54 至 +0.621 范围内，沿冠状面切割厚度为250 μm的纹状体脑片。可获得3个完整的脑片，随后可用针将其分割为6个半片。
  5. 在室温下，将脑片置于持续通氧的ASCF中孵育至少1小时，然后再进行探针负载。脑片对FFN511的负载效果良好，且在制备后4小时内仍保持活性，适合成像实验。

2. 加载 FFN511

  1. 配制FFN511加载溶液（含10μM FFN511的ACSF）；同时配制含100μM ADVASEP-7的ACSF。所有溶液均需现配，并在使用前至少氧合15分钟。
  2. 将脑片分别置于FFN511加载溶液中，在室温下孵育30分钟。
  3. 随后将已加载染料的脑片转移至含氧的100μM ADVASEP-7 ACSF溶液中，在室温下孵育30分钟，以去除与细胞外组织结合的染料2。此时脑片即可用于成像。

3. 在脑切片中成像FFN511

使用多光子激光扫描显微镜对切片中的FFN511进行成像。我们采用Prairie Ultima多光子激光扫描显微镜（此前曾使用Zeiss LSM 510 NLO多光子激光扫描显微镜，部分结果由Zeiss显微镜获得）。

  1. 将载有FFN511的脑片置于记录室（RC-27L，Warner）中，并以氧合人工脑脊液（ACSF）以每分钟1-2 ml的流速进行灌流。然后在脑片上方放置带尼龙丝的铂金网格，以尽量减少实验过程中的移动。为进一步减少移动，在成像前需让脑片在记录室中稳定至少10分钟。
  2. 在10倍水浸物镜下，利用明场透射光观察并定位背侧纹状体。
  3. 若进行刺激实验，将双极绞合钨电极置于该区域。理想的成像区域位于刺激用双极电极两个尖端之间300 μm范围内。将该区域置于视野中央。
  4. 在63倍（0.9 NA）水浸紫外物镜下对FFN511标记的纹状体末梢进行成像。使用Spectral Physics公司的Mai Tai激光器在760 nm波长激发FFN511，通过带通滤光片（480-520 nm）可观察到纹状体末梢的最佳荧光信号。图像以12位格式采集，感兴趣区域为75 × 75 μm，分辨率为512 × 512像素。对于刺激去染实验，为补偿z轴漂移，每个时间点需在z轴方向以1 μm间隔采集5-7张z轴层扫图像。

4. FFN511 脱色

FFN511 标记可通过高浓度 KCl（我们使用 70 mM KCl）、(+)-苯丙胺硫酸盐（AMPH，20 μM）或电刺激进行脱标。在 KCl 脱标实验中，当高钾人工脑脊液（ACSF）施加于脑片时，FFN511 标记在 2 分钟内即发生脱标。记录 xyz-t 图像以随时间追踪 FFN511 的脱标过程。以下描述依赖于电刺激的多巴胺末梢脱标：

  1. 为追踪 FFN511 随时间的脱染过程，需采集 xyz-t 图像。为确保脑片移动最小（z 轴方向小于 4 μm）且激光不引起光漂白，应在刺激前至少采集 5 分钟的 z 层扫描对照时间序列图像。否则，应调整激光功率。
  2. 在获取上述对照图像后，继续进行 xyz-t 成像，同时以 1、4 或 20 Hz 的频率开始刺激。通过由 Master-8 脉冲发生器（AMPI，Jerusalem，Israel）触发的 Iso-Flex 刺激隔离器，使用双极电极在纹状体局部施加 1、4 或 20 Hz（300 μs × 1 mA）的刺激。为尽量减少释放位点去极化的变异，我们采用的刺激方案为通过循环伏安法确定的最大刺激强度的 150%。
  3. 使用适当的软件进行成像分析。在本实验室中，我们使用 Image J（Wayne Rosband，美国国立卫生研究院，Rockville，MD）以及基于 IDL（Research Systems，Boulder，CO）编写的自定义软件来定量分析荧光斑点及其随时间的变化3。

代表性结果

图1显示FFN511在纹状体脑片中的加载现已完成。图1展示了使用10倍和60倍物镜拍摄的代表性图像。多巴胺能末梢的特异性标记可被20 μM苯丙胺脱色。
图2显示高浓度KCl导致FFN511标记的脱色现象。
图3显示局部电刺激引起FFN511标记的脱色。

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图1. FFN511 标记活体皮质-纹状体急性脑片中的多巴胺能神经末梢。(A) 急性活体皮质-纹状体脑片中 FFN511 的标记结果：纹状体（STR）内标记信号丰富，皮质（CTX）内标记较少，胼胝体（CC）无标记信号。比例尺：100 μm。(B) 苯丙胺诱导纹状体中 FFN511 荧光信号的消退。左图：苯丙胺处理前；右图：20 μM 苯丙胺处理 20 分钟后。比例尺：10 μm。

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图2. 高浓度KCl去除FFN511标记。在ACSF中施加70 mM KCl 2分钟内即可去除FFN511标记。比例尺：10μm。

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图3. 纹状体中FFN511标记的频率依赖性脱色。(A) 在4 Hz下的局部刺激导致末梢脱色。刺激始于t = 0。比例尺：5 μm。(B) FFN511在4 Hz下的脱色具有Ca2+依赖性和频率依赖性。对照组未接受刺激（来自3个切片的153个 puncta）。氯化镉（200 μM）处理下的脱色与未刺激对照组相同（来自5个切片的475个 puncta）。各刺激频率下的脱色曲线通过单指数衰减函数拟合，并根据τ × 0.693计算半衰期（t1/2）值（1 Hz：来自9个切片的765个 puncta，4 Hz：来自7个切片的410个 puncta，20 Hz：来自6个切片的416个 puncta）。请参见在纹状体脑片制备中，通过双光子显微镜记录的FFN511在胞吐过程中脱色的视频显微图像。

讨论

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在本视频中，我们演示了一种利用荧光多巴胺类似物光学可视化神经递质释放的方法。FFN511 是我们开发的第一代荧光神经递质探针（FFNs）。尽管该探针的设计靶向神经元囊泡单胺转运体（VMAT2），该转运体负责将单胺类神经递质从细胞质转运至突触囊泡，并特异性地标记纹状体中的多巴胺能末梢以及皮层中假定的儿茶酚胺和/或5-羟色胺能末梢（如《科学》论文所示），但由于 FFN511 具有相对较强的疏水性，因此适当的孵育时间对特异性至关重要。我们发现，在纹状体脑片中孵育超过 40 分钟会导致广泛的非特异性染色。通过使用高浓度 KCl 去染色，可直接评估其特异性，KCl 应促使功能性突触囊泡内的 FFN 释放。若脑片与 FFN511 接触时间少于 15 分钟，则因染料在末梢中加载不足，荧光信号将较弱。在本实验方案中，我们使用 100μM ADVASEP-7 去除染料在细胞外组织中的结合。此步骤并非必需，但如果省略，则需延长在人工脑脊液（ACSF）中的洗脱时间。总之，根据所选用的实验样本，您需要调整染料浓度和孵育时间，以确定最佳标记条件。

披露

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作者无任何披露信息。

致谢

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D. Sames 感谢 G. Harold 与 Leila Y. Mathers 慈善基金会以及哥伦比亚大学科学与工程计划的支持。
D. Sames 和 D. Sulzer 感谢麦克奈特基金会颁发的神经科学技术创新奖。
D. Sulzer 感谢美国国家药物滥用研究所（NIDA）、美国国家精神卫生研究所（NIMH）以及皮考尔基金会和帕金森病基金会的支持。
H. Zhang 感谢 NARSAD 的支持。
R.H. Edwards 感谢迈克尔·J·福克斯基金会、国家帕金森基金会、美国国家药物滥用研究所（NIDA）和美国国家精神卫生研究所（NIMH）的支持。
我们感谢 Robert Burke 提供 6-OHDA 注射及建议，Mark Sonders 提出的有益讨论，Merek Siu 在成像分析编程方面的帮助，以及 Jan Schmoranzer 在全内反射荧光显微镜（TIRF）系统搭建中提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FFN511（8-(2-氨基-乙基)-2,3,5,6-四氢-1H,4H-11-氧杂-3a-氮杂-苯并[de]蒽-10-酮）Columbia University - Dalibor Sames 实验室
ADVASEP-7 CyDexAR-OA7-005
RC-27L 记录室Warner Instruments64-0375
PELCO PrepEze 6孔支架Ted Pella, Inc.36157-1用于脑片孵育
Master-8 脉冲刺激器与 Iso-Flex 刺激隔离器AMPI

参考文献

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  1. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
  2. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).">Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
  3. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).">Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).

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FFN 511 D2

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