安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

Summary

このプロトコルは、chemoeffectorsの安定した濃度勾配で細菌の走化性を調べるためのマイクロ流体デバイスの開発を説明します。

Abstract

走化性は、細菌が誘引物質の源にアプローチするか、撥化学物質の発生源を避けることができます。細菌は、常に数秒前の検出濃度に現在の濃度を比較することによって、特定のchemoeffectorsの濃度を監視する。この比較では、運動の正味の方向を決定します。複数の、競合する勾配がしばしば自然の中で共存していますが、細菌の走化性を調査するための従来のアプローチは、誘引と忌避剤の濃度勾配に反応して移行を定量化するための次善のです。ここで、我々は、細菌にchemoeffectorsの正確で安定した濃度勾配を提示し、定量的に適用される勾配への応答を調べるためのマイクロ流体走化性モデルの開発について説明します。デバイスは、任意の所望の絶対濃度と勾配の強さのその濃度勾配で汎用性が容易に拡散混合によって生成することができます。デバイスは、応答のを使用して示されている

Protocol

1。標準のSU - 8フォトリソグラフィー^1（ このビデオでは図示せず）を用いてシリコンのマスターの作製。

1. マイクロ流体ネットワークと走化性チャンバーを含むPDMSモールドを製造するためのSU - 8"マスター"（SU - 8 2025、マイクロケム、ニュートン、MA）を作成するための標準的なSU - 8フォトリソグラフィーの手法を使用してください。このようなマスターの金型は、任意の微細加工施設（;例えば、スタンフォードマイクロフルイディクス鋳造で作製することができるhttp://thebigone.stanford.edu/foundry/ ）。
2. PDMSの複製の前に、マスタからPDMSの簡単なリリースを容易にするために真空源に接続されたデシケーター内フルオロシラン蒸気にSU - 8マスターを公開。ペーパータオルにフルオロシランの滴を加え、1分間のために真空を適用する。真空を削除し、フルオロシランの堆積のための30分を許可する。 SU - 8今後の使用のために密閉容器に入れてマスターしてください。

2。 PDMSのレプリカ成形SU - 8からマスター：流体層と制御層は、SU - 8マスターからPDMSのレプリカ成形によって作られています。

1. 午前10時01分重量でPDMSプレポリマーと架橋剤を混ぜる。 1時間（または気泡がPDMSの混合物から除去されるまで）のデシケーター中での比率とドガ。
2. ペトリ皿にSU - 8マスターを置き、慎重に所望の厚さにSU - 8マスターの上にPDMSの混合物を注ぐ。
3. PDMSと℃で2時間、Cは、PDMSを治すために80 SU - 8マスターモールドを含むペトリ皿を加熱する。
4. ホットプレートからとSU - 8のマスターからPDMSモールドピール硬化PDMS -覆われたSU - 8マスターを削除します。所望の構造は、PDMSモールドに埋め込まれます。
5. 20ゲージの平滑末端針を使用してグラデーションのジェネレーターとセルの入口に配管するためのPDMSモールドのパンチ穴。

3。 PDMSデバイスのボンディング：

1. イソプロパノール及び窒素または空気の流れと乾燥によるガラスの顕微鏡スライドを清掃してください。
2. プラズマアッシングにおける酸素プラズマにPDMS、ガラススライドを公開します。
3. スライドガラスに接触PDMSモールドをもたらす。 65に接触するスライドとPDMSモールドを加熱℃で15分間。

4。 PDMSデバイスの組み立て

1. カミソリの刃を使用して、45でチューブをカット·デバイスに必要な正しい長さの角度。
2. 鉗子を使用してデバイス（例えば、コンセント）にパンチ穴にチューブの一端を挿入します。
3. 鉗子を使用して、チューブのもう一方の端に鈍30ゲージの針を挿入する。
4. すべての残りの穴に対して、手順4.2を繰り返します。
5. シリンジから気泡を取り除くように注意しながら、3mlの注射器で走化性バッファ（CB）の1mlを収集する。
6. アウトレットチューブの一端に針ハブを固定する。
7. 針ハブにCBを追加し、気泡を除去するために針ハブをタップします。
8. 注射器の先端の少しCBアウトを押し込み、空気をトラップすることなく、針ハブに3MLシリンジを接続してください。
9. 残りのすべての針のハブがCBとで満たされるまでデバイスを介してCBを押してください。これは、気泡の大部分を削除する必要があります。
10. chemoeffectorテスト中の適切な濃度で含有するCB二つ500μLシリンジを埋める。注射器の内容の小滴を押し出すと針ハブの液体へのドロップをタッチして接続することによって気泡の形成を排除する。
11. 同様に、細菌の入口にCBを含むシリンジを接続してください。細菌がデバイスに導入されるときに削除されます。

5。非常に運動性のE.の成長大腸菌

1. E.の一晩培養して成長する大腸菌振盪しながら32℃でトリプトンブイヨン（TB）20 mLのプラスミドGFPの発現とRP437。プラスミドを維持するために抗生物質の適切な濃度を追加。我々のプロトコルでは、我々はデバイスの蛍光に基づいて、細菌を検出するための低コピープラスミドpCM182を使用してください。 E.用大腸菌 、32で成長している文化℃の場合は運動性がより高い温度で低いので、高い運動性をお勧めします。
2. 〜0.05の600nmの光学密度に250mLの三角フラスコにTB 20 mlの培養液を接種するために一晩培養を使用してください。 32で振とう培養を育て℃を
3. 5分で400 × gで低速遠心で〜0.35 0.45のOD ₆₀₀で細胞を回収する。
4. チャネルの途中で予想される濃度でchemoeffectorを含むCBで〜0.35のOD ₆₀₀に細胞を再懸濁します。
5. GFP発現生きている細胞に〜0.35のOD ₆₀₀でRFPで標識された死細胞を追加。死んだ（赤色）のセルには、任意の移行が流れの影響によるものではないことを保証するために内部コントロールとして使用されています。

6。モニタリングの走化性

1. セル入口の針からCBの一部を取り除くハブ。細胞懸濁液を補充。
2. 静かに再懸濁した細胞を50μLシリンジを埋める。鞭毛がせん断することができ、運動性を低下させるため、この手順では、徐々に行う必要があります。
3. 手順のステップ4.10に説明したように口針のハブに50μLシリンジを取り付けます。
4. 画像取得のための高速度カメラを装備した蛍光顕微鏡のステージ上にデバイスを配置します。シリンジポンプ入口側のシリンジを（両方500μL勾配のシリンジと50μLの細胞シリンジ）を配置し、勾配が形成され、細胞はチューブを流れているように、フローを開始します。
5. 一度細胞が走化性チャンバーを入力し、イメージングの前に安定させるためのシステムのために〜20分待ちます。
6. チャンバーの長さに沿って異なる位置（異なる露光時間に相当）で緑（ライヴ）と赤（死んだ）蛍光画像を収集する。一般的に、我々は3秒間隔で各場所で100枚の画像を収集する。

7。データ解析：以下の手順は、任意の市販の画像解析のプログラム（例えば、ImageJを、Metamorph）を使用するか、MATLABで書かれたシンプルなコードを使用して実行できます。

1. 画像の背景のピクセルを削除する（すなわち、しきい値のピクセルの強度を設定し、以下のしきい値よりも強度を持つすべてのピクセルを削除）。分析のこのノイズを最小化。
2. 画像の中心を決定するために、死細胞（赤色蛍光）の位置を使用してください。死んだ細胞が走化性を示していないので、これは細胞が走化性チャンバーを入力し、任意の移行がない場合に検出される位置を表します。
3. 画像に生きた細胞を（緑色蛍光）を探します。
4. チャンネルに画像を分割し、各チャンネルで生細胞の数を決定します。私たちの前の仕事³では、1050μm幅走化性チャンバーは、それぞれ〜16μmの幅で64チャンネルに分割されました。
5. すべての画像に対して、手順7.1の7.3を繰り返し、すべての画像間で各チャンネルの総細胞数を合計します。これは、実験期間中での各チャンネルで検出された総細胞数を与えます。
6. 高濃度（右）と低濃度（左）死細胞の両側にある各セルは、+1と-1の乗数が割り当てられている：次のように、移行の方向を表す走化性の分配係数（CPC）を、計算する、それぞれ。これは、勾配を下って、細胞が-1で乗算されている間1を乗算した勾配を移行するセルです。すべての乗算値を加算し、検出されたセルの合計数に正規化されています。例えば、0.40のCPCの値は合計細菌の40％以上が低濃度側（すなわち、より多くの細菌が勾配を上に移動検出されたとしてchemoeffectorが誘引である）よりも高濃度側に移動したことを示します。
7. 重量を各チャネルの細胞数細胞が移動した距離に比例する係数で次のように距離によって細胞の遊走を重走化性の移行係数（CMC）を、計算では、旅。途中で高濃度側に移動する一つが0.5の重み係数、および最も遠いため、移動セルを与えているのに対し、最も遠い高濃度の位置（チャネル64）に移動するセルは、1の重み係数が与えられます低濃度の位置は-1で重みが付けられます。すべての重み付けセルの数を総括し、CMCを生成する細胞の数に正規化する。

代表的な結果^3,4：

我々は、マイクロ流体デバイス（ 図1A）は Eの走化性を調査するためにここで説明に使用されている誘引（アスパラギン酸、オートインデューサー-2）と防虫剤の勾配で大腸菌 （NISO _4、インドール^）3,4。典型的走化性菌株⁵ E.大腸菌 RP437を発現するGFPは、カナマイシン殺さE.とともに、使用されたフローの影響を監視するために赤色蛍光タンパク質を発現する大腸菌 TG1細胞。 μFlow装置で形成された濃度勾配は、 図1Bに示されています。セルの入口は、それを介して、フローとfluoressceinのng / mLのがデバイスに設立された0〜100の安定勾配がないように蓋をした。デバイス間のピクセル強度はフルオレセインの濃度プロファイルを決定するために使用されていました。データは、走化性チャンバーを入力したときに細菌が線状グラデーションが発生したことを示している。 図2A及びBは E.の蛍光画像を示していますアスパラギン酸（0〜100μM）とNISO _4（0 225μM）の勾配に応じて、 大腸菌 RP437移行。観測されたこれらの標準的な誘引への対応と撥は、予測されている。 図3Aは Eの定量分布を示す大腸菌 RP437 濃度勾配が存在しない場合（すなわち、アスパラギン酸のヌル勾配）で、一方、図3BおよびCは、アスパラギン酸とNISO ₄の勾配で分布を示す。これらの応答の特異性（すなわち、移行のバイアスは）E.として明らかである大腸菌 RP437Δ タールひずみ（すなわち、アスパラギン酸とニッケルを検知するために、大腸菌で使用されているタールの化学受容器を欠いた株は）アスパラギン酸またはNISO ₄の濃度勾配の存在下での移行のバイアスを示すものではありません。空間分布のプロファイルで明らかな傾向は、また計算されたCPCとCMC値と一致している。 E.の移行のためのCPCの値アスパラギン酸またはNISO ₄の勾配で大腸菌 RP437は、それぞれ0.33と-0.33です。対応するCMC値はそれぞれ0.13と-0.14です。 E.とは対照的に、CPCとCMCは、値アスパラギン酸またはNISO ₄の勾配で大腸菌 RP437Δ タール菌株はごくわずかです。さらに、アスパラギン酸のヌル勾配でCPCとCMCは、それぞれ0.03と0.02、であり、勾配がない場合の移行におけるバイアスの欠如を示している。

図1。デバイスの回路図と濃度勾配 。
（A）マイクロ流体走化装置の模式図を。このデバイスは、勾配混合モジュール（20 × 100 × 18750程度）と走化性の観察モジュール（20 × 1050 X 11500程度）で構成されています。デバイスに入る2つの勾配のチャネルの幅は500μmであり、細菌の入口の幅は50μmである。挿入図は、シグナル伝達分子（灰色）とそれに反応して移行する細菌の勾配を示しています。死菌がオープン楕円形として示されているのに対し、生菌は、固体楕円形として描かれている。 （B）0から100 ng / mLのフルオレセインの間に濃度勾配は、デバイスで生成され、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。蛍光画像は、30分後に取得し、画像解析によって定量した。

図2。 E.の走化性マイクロ流体デバイスにおける大腸菌 RP437。
大腸菌は、RP437は、（）0から100μML -アスパラギン酸または（B）0から225までのデバイスでμMNISO ₄とL -アスパラギン酸または離れてニッケルから向かって生菌のマイグレーション（緑）の勾配にさらされていた30分間ごとに2.5秒をイメージ。死菌（赤）は、デバイスのフロー効果のためのコントロールとして役立った。画像は、分析PROGRAM3を開発した社内で使用して定量した。示されたデータは、3つの独立した実験から代表的な擬似カラー画像です。

図3：標準的な誘引と忌避剤への移行プロファイルの定量化。
（）一様100μMのL -アスパラギン酸（すなわち、無勾配）、アスパラギン酸の（B）0 100μMの勾配、およびNISO ₄の（C）0 225μMの勾配に応じて、マイクロ流体デバイスにおけるRP437の空間分布。死んだ細胞の分布は実線として表示され、RP437細胞の分布は、破線で示されている、とRP437 EDA ^+Δ タール細胞の分布は点線として表示されます。ここに示すデータは、3つの独立した実験のために平均化されています。

Discussion

真央ら ⁵で説明される走化性の分配係数（CPC）と走化性の移行係数（CMC）を計算することができます。細胞が高濃度側で検出された場合は低濃度側で検出されたセルは、-1の値を与えているのに対し、それは、+1の値を与えられます。値は合計し、単価を生成するセルの合計数によって分けられています。 CPC（正または負）の符号は、移行の方向（信号から向かってまたは離れて）になります。 CPCは、細胞が誘引や忌避剤などの化学物質に応答するかどうかを示すものの、それは走化性の程度を定量化していません。このため、我々は64のセクション（セル入口の両側では32）にデバイスの幅を横切って細菌の空間分布のプロファイルを分割し、との距離に基づいて、各セクションのセルに重み係数を割り当てることによって、CMCを計算する移行。彼らは最大距離を移行した細胞が含まれているので、中央（セクション1〜64）から最も遠い部分は+1（= 31.5/31.5）または-1で乗算されます。次の2つのセクションは（2、63）0.968（= 30.5/31.5）または-0.968が乗算される。最後の2つのセクション（すなわち、セルの入口に最も近い32および33）+ 0.015（= 0.5/31.5）または-0.015が乗算される。加重値は、CMCを生成するためにセルの合計数を合計し、正規化されています。 +1のCMCは、すべての細菌がフローチャンバーの壁に勾配の上、完全に移動したことを示しています。 CPCの値がまだ1になるのに対し、軽度の魅力的な応答の場合には、CMCはまだ、正でなければ、より小さい値を持つことになります。このようにCMCは、移行の程度に基づいて応答性の細胞を区別します。

特定のパラメータには、走化性の実験を行いながら慎重に制御する必要があります。細菌が栽培される温度は重要です。 E.用大腸菌 、我々は最高の成長温度は32℃と高い温度は運動性を減らすためであることを観察した。細菌に存在している特定の受容体の場合、それは（すなわち、走化性のために細胞をプライミングする）chemoeffector誘導の存在下で細菌を成長させるために必要な場合があります。例えば、マルトースへの細菌の応答を調査する際、細胞は砂糖の0.1％（w / v）ので栽​​培されています。遠心分離後に細菌を再懸濁するときに、それは穏やかなチューブの揺れ/圧延が行われ、細胞をボルテックスしないことが重要です。激しく振盪はテストされている細胞の運動性を減少させるせん断鞭毛をすることができますし。デバイスで使用される流量は、テストされている細菌の運動性に基づいて決定する必要があります。低速流量が少ない運動な細菌のために必要になることがあります、と最適な流量は、経験的に決定する必要があります。

我々はμFlowデバイスが誘引や忌避剤などの特定の化学物質への対応の環境試料中の細菌を特定するのでなく、細菌走化性に関する基礎的研究（例えば、同じ受容体に対するchemoeffectors間の競争）に使用できることを期待しています。