Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के photoconversion एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग पर प्रदर्शन के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हम puried प्रोटीन के नमूने के photoconversion, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mOrange2 और Dronpa के साथ जीवित कोशिकाओं में दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग के लिए के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन.
Abstract
Photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पीसी fps) "ऑप्टिकल हाइलाइटर" क्षमता के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक वर्ग, जिसका अर्थ है कि प्रतिदीप्ति के रंग एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के संपर्क में द्वारा बदला जा सकता हैं. ऑप्टिकल हाइलाइटिंग noninvasive फ्लोरोसेंट अणु के एक subpopulation के अंकन की अनुमति देता है, और इसलिए एकल कक्षों या organelles पर नज़र रखने के लिए आदर्श है.
कुशल photoconversion लिए गंभीर मापदंडों photoconversion प्रकाश की तीव्रता और जोखिम समय कर रहे हैं. यदि तीव्रता बहुत कम है, photoconversion या सभी में होते धीमा नहीं किया जाएगा. दूसरी ओर, तीव्रता बहुत ज्यादा या बहुत लंबे समय जोखिम प्रोटीन photobleach और जिससे photoconversion की दक्षता को कम कर सकते हैं.
यह एक सामान्य दृष्टिकोण कैसे करने के लिए पीसी एफपी photoconversion अनुप्रयोगों के लिए लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग सेट प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. सबसे पहले, हम शुद्ध प्रोटीन छोटी बूंद नमूने तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. यह नमूना स्वरूप फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खुर्दबीन के नीचे photophysical व्यवहार का अध्ययन करने के लिए बहुत सुविधाजनक है. दूसरा, हम प्रोटीन छोटी बूंद नमूना उपयोग करने के लिए दिखाने के लिए कैसे photoconversion के लिए माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगर करने के लिए होगा. और अंत में, हम दिखा देंगे कि कैसे mOrange2 और Dronpa के साथ दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग सहित जीवित कोशिकाओं में ऑप्टिकल हाइलाइटिंग प्रदर्शन करने के लिए.
Protocol
1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन छोटी बूंद के नमूनों की तैयारी
एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन छोटी बूंद नमूना फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ पानी के चरण में रहने 1-octanol/water पायस के होते हैं. इस पायसन एक खुर्दबीन और माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए एक 22 मिमी वर्ग कवर गिलास स्लाइड के बीच sandwiched है.
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन छोटी बूंद के नमूनों बनाने से पहले माइक्रोस्कोप स्लाइड और कवर चश्मा साफ है और एक hydrophobic एजेंट के साथ लेपित किया जा जरूरत है.
- एसीटोन के साथ 5 मिनट धोने से कांच के बने पदार्थ साफ और हवा से सूखे छोड़. (वैकल्पिक रूप से, कांच के बने पदार्थ की सफाई के बाद एक प्लाज्मा क्लीनर में 30 सेकंड के लिए इलाज किया जा करने के लिए इष्टतम कोटिंग परिणाम प्राप्त कर सकते हैं).
- इस समाधान में एक 2 मिनट ऊष्मायन के दौरान एक 2% एसीटोन और कांच के बने पदार्थ कोट में methyltrimethoxysilane समाधान तैयार करें. कोटिंग के बाद समाधान से कांच के बने पदार्थ को हटाने और हवा से सूखे छोड़. फिर 70% इथेनॉल के साथ एक स्प्रे बोतल से कुल्ला और फिर सूखे छोड़. (वैकल्पिक रूप से, इस बिंदु पर कांच के बने पदार्थ 80 पर 1 घंटे के लिए पकाया जा डिग्री सेल्सियस covalently कांच के बने पदार्थ के लिए कोटिंग लिंक कर सकते हैं). लेपित कांच के बने पदार्थ कम से कम एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- प्रतिदीप्त प्रोटीन उनकी ई. से 6-टैग प्रोटीन के रूप में शुद्ध कर रहे हैं 1 कोलि. शुद्ध प्रोटीन की absorbance के स्पेक्ट्रम उपाय और Ste बफर (150 मिमी NaCl, 10 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8, 1 मिमी EDTA) में 0.1 ~ के ऑप्टिकल घनत्व के साथ एक शेयर कमजोर पड़ने तैयार करने के लिए, 0.1% गोजातीय सीरम albumin युक्त (BSA) . इसके अलावा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 1-octanol और Ste बफर के एक 1:1 मिश्रण के 10 मिलीलीटर तैयार और सख्ती मिश्रण. मिश्रण छोड़ के बाद जब तक चरण जुदाई पूरा हो गया है. शीर्ष चरण 1 octanol है. (चेतावनी: क्योंकि 1-octanol एक मजबूत गंध है यह महत्वपूर्ण है के लिए सब कुछ है कि 1 octanol के साथ संपर्क में आता है के लिए एक बंद बर्बाद कंटेनर का उपयोग करें.)
- पायस विंदुक 45 μl 1-octanol और एक microfuge ट्यूब में 5 μl फ्लोरोसेंट प्रोटीन बनाने के लिए. ट्यूब अपनी उंगली के साथ कुछ समय ठोकर पायस के गठन शुरू करने और फिर एक sonication स्नान में 30 सेकंड के लिए ट्यूब sonicate. इस बीच एक लेपित खुर्दबीन स्लाइड और कांच तैयार कवर. Sonication के बाद पायस पूरी तरह से बादल होना चाहिए. तुरंत एक लेपित खुर्दबीन स्लाइड पर sonication विंदुक 4 ट्यूब के बीच से μl पायस के बाद और एक लेपित कवर गिलास के साथ कवर.
- यदि प्रक्रिया सही ढंग से किया जाता है पायस खुर्दबीन स्लाइड और शीशा के बीच समान रूप से फैल चाहिए. मिनट के भीतर नमूना स्थिर हो ~ 10 सुक्ष्ममापी के व्यास बदलती के साथ मोटी फ्लोरोसेंट बूंदों मिलकर करना चाहिए. सबसे बड़ी बूंदों के नमूने के केंद्र के पास हैं और छोटे आगे किनारों की ओर स्थित हैं.
2. एक photoconversion प्रयोग की स्थापना
निम्न कार्यविधि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन photoconversion प्रयोग की स्थापना के लिए एक सामान्य रणनीति है. इस प्रक्रिया प्रोटीन जीवित कोशिकाओं के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शुद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है.
- निम्न पैरामीटर एक सामान्य प्रारंभिक बिंदु अपने photoconversion प्रयोग सेट प्रदान करते हैं:
40x 1.3NA तेल विसर्जन उद्देश्य
छवि का आकार = 512 x 512 पिक्सल
ज़ूम स्कैन = 4
पिक्सेल = 6 μsec समय ध्यान केन्द्रित करना.
Z संकल्प (pinhole आकार) = 3 सुक्ष्ममापी - दो प्रारंभिक और photoconverted प्रतिदीप्ति के लिए पता लगाने के चैनल, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक "photoconversion चैनल" कॉन्फ़िगर. इस उदाहरण में हम शुद्ध mOrange2 प्रोटीन है, जो एक नारंगी लाल photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग करेंगे. नारंगी प्रजातियों 561 एनएम उत्तेजना और प्रतिदीप्ति 570 एनएम और 630 एनएम के बीच एकत्र किया जाता है का उपयोग करने के लिए पता चला है. photoconverted लाल प्रजाति 633 एनएम उत्तेजना और प्रतिदीप्ति 640 एनएम और 700 एनएम के बीच एकत्र किया जाता है का उपयोग कर पता लगाया है. के लिए "photoconversion चैनल" 488 एनएम उत्तेजना का चयन और 490 एनएम और 540 एनएम के बीच प्रतिदीप्ति इकट्ठा. (नोट: इमेजिंग photoconversion चैनल कड़ाई आवश्यक नहीं है)
- लगातार स्कैनिंग लेजर शक्ति और इष्टतम छवि गुणवत्ता के लिए डिटेक्टर प्राप्त समायोजित के साथ प्रारंभिक प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए चैनल का उपयोग करें.
- Photoconversion चैनल सक्रिय और एक कम लेजर शक्ति का चयन करें. इमेजिंग एक समय व्यतीत हो श्रृंखला शुरू करें और धीरे धीरे photoconversion लेजर में वृद्धि जब तक प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के विरंजन महत्वपूर्ण मनाया जाता है. स्कैनिंग प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तक लगभग 75% प्रक्षालित है जारी रखें.
- Photoconversion चैनल निष्क्रिय और photoconverted प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए चैनल को सक्रिय. इमेजिंग के एक उच्च डिटेक्टर लाभ और कम लेसर शक्ति के साथ आरंभ और धीरे धीरे लेसर शक्ति में वृद्धि जब तक photoconverted प्रतिदीप्ति का पता चला है. एक बार जब आप photoconverted प्रतिदीप्ति आप लेजर शक्ति और इष्टतम छवि गुणवत्ता के लिए डिटेक्टर प्राप्त समायोजित कर सकते हैं का पता लगाने.
- अंत में, लेसर शक्ति का इस्तेमालके रूप में के रूप में अच्छी तरह से photoconversion के लिए photoconversion की अवधि के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है. Photoconversion लेजर शक्ति बढ़ाने photoconversion की दर में तेजी लाने, लेकिन बहुत ज्यादा लेसर शक्ति प्रोटीन photobleach जाएगा.
- एक बार इष्टतम photoconversion लेसर शक्ति और अवधि निर्धारित किया गया है, इन मानकों के लिए एक मानक photobleaching या FRAP मॉड्यूल और "photoconversion चैनल" अब आवश्यक नहीं है कॉन्फ़िगर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. MOrange2 और Dronpa के साथ दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग
लाल स्थानांतरित वर्णक्रमीय गुण की वजह से, mOrange2 हरी photoswitchable दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन Dronpa के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है 4 व्यक्ति (organelle) सेल आबादी के चुनिंदा हाइलाइटिंग की अनुमति.
- कक्ष गिलास नीचे MatTek बर्तन में बड़े हो रहे हैं और 24 घंटे के मानक Lipofectamine2000 एक अभिकर्मक का उपयोग इमेजिंग के लिए पहले ट्रांसफ़ेक्ट.
- MOrange2 के रूप में धारा 2 में वर्णित photoconversion के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें.
- Dronpa photoswitching के लिए माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगर. Dronpa प्रतिदीप्ति mOrange2 "photoconversion चैनल" (2.2 कदम देखें) का उपयोग imaged किया जा सकता है. (नोट: लेजर इमेजिंग Dronpa के लिए इस्तेमाल किया शक्ति को न्यूनतम करने के लिए, क्योंकि बहुत ज्यादा लेसर शक्ति Dronpa की निष्क्रियता के कारण होगा.) Dronpa photoactivation के लिए एक चैनल जोड़ें. हम दो photon उत्तेजना photoactivation के लिए 800 एनएम, का उपयोग करें, लेकिन वैकल्पिक रूप से इस 405 एनएम उत्तेजना का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है. लेजर इमेजिंग के लिए आवश्यक बिजली, photoactivation, और Dronpa प्रतिदीप्ति के photoinactivation का निर्धारण करते हैं.
- सावधानी: mOrange2 के Photoconversion और Dronpa की निष्क्रियता दोनों 488 एनएम उत्तेजना पर होते हैं. उच्च लेजर mOrange2 photoconversion के लिए बिजली की आवश्यकता की वजह से यह भी Dronpa प्रतिदीप्ति निष्क्रिय होगा. दूसरी ओर, Dronpa निष्क्रियता बहुत कम लेजर सत्ता में पहले से ही होता है और महत्वपूर्ण mOrange2 photoconversion के बिना किया जा सकता है है.
- एक बार mOrange2 photoconversion और Dronpa photoswitching के लिए पैरामीटर सेट कर रहे हैं, दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग निम्न चरणों के माध्यम से हासिल की है. सबसे पहले, कम बिजली की 488 एनएम उत्तेजना के साथ देखने के पूरे क्षेत्र में Dronpa प्रतिदीप्ति निष्क्रिय. दूसरा, ब्याज और उच्च शक्ति 488 एनएम उत्तेजना के साथ photoconvert mOrange2 के एक क्षेत्र का चयन करें. अंत में, Dronpa प्रतिदीप्ति को सक्रिय करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करें.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. छोटी बूंद नमूना तैयारी एक) सही ढंग से तैयार छोटी बूंद नमूना. बी) खुर्दबीन स्लाइड और कवर ग्लास कोटिंग के बिना तैयार की गई नमूना. सी) 0.1% BSA जोड़ने के बिना तैयार की गई नमूना.
चित्रा 2. Photoconversion लेजर और mOrange2 photoconversion पर सत्ता की अवधि का प्रभाव है. एकल mOrange2 प्रोटीन युक्त बूंदों लगातार 488 एनएम लेजर शक्ति के विभिन्न मात्रा का उपयोग photoconverted थे. सापेक्ष लेजर photoconversion के लिए इस्तेमाल किया शक्ति 10% (ठोस), 25% (धराशायी), और 100% (डॉटेड) था. ए) ऑरेंज फ्लोरोसेंट प्रजातियों. बी) Photoconverted लाल फ्लोरोसेंट प्रजातियों.
चित्रा 3. MOrange2 और Dronpa के साथ दोहरी जांच ऑप्टिकल ए) photoconversion पहले mOrange2 histone H2B और Dronpa - Mito व्यक्त सेल नाभिक और mitochondria में हरी प्रतिदीप्ति में नारंगी प्रतिदीप्ति दिखाने पर प्रकाश डाला. बी) Dronpa प्रतिदीप्ति से कम बिजली की 488 एनएम उत्तेजना के साथ बंद किया गया था, mOrange2 के न्यूनतम photoconversion के कारण. सी) mOrange2 उच्च शक्ति 488 एनएम उत्तेजना के साथ लाल photoconverted था. डी) Dronpa प्रतिदीप्ति फिर से 800 एनएम 2-photon उत्तेजना के प्रयोग पर बंद किया गया था. पैनल प्रतिदीप्ति छवियों के ओवरले अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि के साथ एक साथ कर रहे हैं.
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Discussion
शुद्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन छोटी बूंद नमूना फ्लोरोसेंट प्रोटीन की photophysical लक्षण वर्णन के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक नमूना स्वरूप कैनेटीक्स और photoconversion कैनेटीक्स photobleaching अध्ययन करने के लिए उदाहरण के लिए, है. अत्यंत छोटे छोटी बूंद मात्रा (~ 20 picoliter) photobleaching और photoconversion प्रयोगों, जो क्युवेट आधारित सिस्टम में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है सुविधा. इसके अलावा, के रूप में यहाँ दिखाया छोटी बूंद नमूना आदर्श photoconversion अनुप्रयोगों के लिए एक confocal खुर्दबीन की स्थापना के लिए अनुकूल है. hydrophobic कोटिंग और BSA के उपस्थिति सजातीय बूंदों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. कोटिंग बिना बूंदों के लिए एक कांच की सतहों के खिलाफ कुचल हो जाते हैं और BSA के अभाव में फ्लोरोसेंट प्रोटीन 1-octanol/water अंतरफलक पर जमा करते हैं, प्रतिदीप्ति (चित्रा 1) के एक प्रभामंडल बनाने.
फ्लोरोसेंट प्रोटीन photoconversion अक्सर photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (FRAP) के लिए एक विकल्प के रूप में में माना जाता है, लाभ है कि एक भी photoconverted प्रजातियों का पालन कर सकते हैं के साथ. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए photoconversion गंभीर लेजर इस्तेमाल किया और शक्ति पर निर्भर है कि. बहुत photoconversion लेजर शक्ति या भी लंबे समय जोखिम photoconversion बजाय photobleaching कारण है, जिससे photoconverted प्रतिदीप्ति (चित्रा 2) की राशि को कम करने.
mOrange2 और अपने photoconverted प्रजातियों के लाल स्थानांतरित वर्णक्रमीय गुण एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल हाइलाइटर के साथ दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग की अनुमति. यह या तो एक photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Dronpa), के रूप में यहाँ का प्रदर्शन है, या वैकल्पिक रूप से पीए GFP उदाहरण के लिए एक photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन, हो सकता है. Dronpa लाभ है कि एक प्रयोग के शुरू में अपनी उपस्थिति की जाँच कर सकते हैं. दूसरी ओर, Dronpa का उपयोग ऑप्टिकल हाइलाइटिंग पेचीदा है, क्योंकि सभी Dronpa प्रतिदीप्ति पहले निष्क्रिय हो गया है, और इस तथ्य है कि Dronpa प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान धीरे - धीरे बंद. इन जटिलताओं को कम गहरा रहे हैं जब पीए GFP का उपयोग करते हुए, लेकिन photoactivation पहले पीए GFP की उपस्थिति के लिए जाँच और अधिक मुश्किल हो सकता है है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम प्लाज्मिड डीएनए एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रदान करने के लिए धन्यवाद माइक डब्ल्यू डेविडसन (फ्लोरिडा स्टेट यूनिवर्सिटी). यह काम स्वास्थ्य अनुदान GM72048 (DWP के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microsope slides | VWR international | 48312-003 | |
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| methyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
