Summary
Este protocolo describe un método general para llevar a cabo fotoconversión de proteínas fluorescentes en un microscopio láser confocal de barrido. Se describen los procedimientos para la fotoconversión de muestras de proteínas puried, así como de doble sonda óptica destacando en células vivas con mOrange2 y Dronpa.
Abstract
Fotoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PM) son una clase de proteínas fluorescentes con "resaltador óptico" capacidad, lo que significa que el color de la fluorescencia se puede cambiar por la exposición a la luz de una longitud de onda específica. Destacando óptico no invasivo permite el marcado de una subpoblación de moléculas fluorescentes, lo que es ideal para el seguimiento de las células individuales u orgánulos.
Parámetros críticos para fotoconversión eficientes son la intensidad y el tiempo de exposición de la luz fotoconversión. Si la intensidad es demasiado baja, fotoconversión será lento o no ocurrir en absoluto. Por otro lado, demasiada intensidad o la exposición por mucho tiempo puede photobleach la proteína y por lo tanto reducir la eficiencia de fotoconversión.
Este protocolo describe un enfoque general de cómo configurar un microscopio láser confocal de barrido para aplicaciones fotoconversión pc-FP. En primer lugar, se describe un procedimiento para la preparación de muestras purificadas gota de proteínas. Este formato de la muestra es muy conveniente para estudiar el comportamiento fotofísicas de proteínas fluorescentes bajo el microscopio. En segundo lugar, vamos a utilizar la muestra de gota de proteínas para mostrar cómo configurar el microscopio en busca de fotoconversión. Y, por último, vamos a mostrar cómo realizar destacando óptica en células vivas, incluidos los de doble óptica con la sonda destacando mOrange2 y Dronpa.
Protocol
1. Preparación de muestras de proteínas fluorescentes gota
Una muestra de la proteína fluorescente consiste en gotas de una emulsión de 1-octanol/water con la proteína fluorescente que residían en la fase acuosa. Esta emulsión se encuentra entre un portaobjetos de microscopio y un vaso de 22 mm cuadrados para cubrir las aplicaciones de la microscopía.
- Antes de tomar muestras de gotas fluorescentes proteína de los portaobjetos y cubreobjetos deben ser limpiados y recubiertos con un agente hidrófobo.
- Limpiar la cristalería por lavado de 5 minutos con acetona y dejar secar por aire. (Si lo desea, después de limpiar el vidrio puede ser tratada durante 30 segundos en un limpiador de plasma para obtener resultados óptimos de recubrimiento).
- Prepare una solución al 2% metiltrimetoxi en acetona y cubrir el material de vidrio durante una incubación de 2 minutos en esta solución. Después de quitar el revestimiento de vidrio de la solución y dejar secar por aire. Luego enjuague con etanol al 70% de una botella de spray y dejar secar de nuevo. (Si lo desea, en este punto el material de vidrio se pueden hornear durante 1 hora a 80 ° C para unir covalentemente el revestimiento de los recipientes de vidrio). Vidrio recubierto se puede almacenar por lo menos durante un mes.
- Las proteínas fluorescentes se purifican como su proteína de 6 etiquetado de E. Coli 1. Medir el espectro de absorción de la proteína purificada y preparar una dilución de valores con una densidad óptica de 0,1 ~ STE en tampón (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) . Además de preparar 10 ml de una mezcla de 1:1 de tampón 1-octanol y STE en un tubo cónico de 15 ml y mezclar enérgicamente. Después de dejar la mezcla hasta que la separación de fases se ha completado. La fase superior es el 1-octanol. (Atención: Debido a que 1-octanol tiene un olor fuerte que es importante utilizar un contenedor de residuos cerradas por todo lo que entra en contacto con 1-octanol).
- Para hacer la emulsión pipeta 45 l 1-octanol y 5 l de proteínas fluorescentes en un tubo de microcentrífuga. Toque en el tubo de un par de veces con el dedo para comenzar la formación de la emulsión y después sonicar el tubo durante 30 segundos en un baño de ultrasonidos. En el mientras tanto conseguir un portaobjetos de microscopio y cubierta de vidrio recubierto listo. Después de la sonicación de la emulsión debe estar completamente despejado. Inmediatamente después de la sonicación pipeta de 4 l de emulsión de la mitad del tubo en un portaobjetos de microscopio recubiertas y cubra con una tapa de vidrio recubierto.
- Si el procedimiento se realiza correctamente la emulsión se distribuye uniformemente entre el portaobjetos de vidrio y el objeto. En cuestión de minutos la muestra debe ser estable, que consta de aproximadamente 10 micras de espesor gotas fluorescentes con diámetro variable. Las gotas más grandes están cerca del centro de la muestra y los más pequeños se encuentran más hacia los bordes.
2. La creación de un experimento fotoconversión
El siguiente procedimiento es una estrategia general para la creación de un experimento de la proteína fluorescente fotoconversión. Este procedimiento se puede aplicar a las proteínas purificadas, así como para las células vivas.
- Los parámetros siguientes se ofrece un punto de partida general para configurar la prueba fotoconversión:
40x aceite 1.3NA objetivo de inmersión
Tamaño de la imagen = 512 x 512 píxeles
Exploración zoom = 4
Pixel tiempo de espera = 6 mseg.
Z-resolución (tamaño del agujero de alfiler) = 3 m - Configurar dos canales de detección de la fluorescencia inicial y photoconverted, así como un "canal fotoconversión". En este ejemplo vamos a utilizar las proteínas purificadas mOrange2, que es una naranja y rojo que la proteína fluorescente fotoconvertible. Las especies de naranja se detecta utilizando 561 nm de excitación y la fluorescencia se recoge entre 570 nm y 630 nm. La especie roja photoconverted se detecta utilizando 633 nm de excitación y la fluorescencia se recoge entre 640 nm y 700 nm. Para el "canal fotoconversión" seleccionar 488 nm de excitación y recoger fluorescencia entre 490 nm y 540 nm. (Nota:. Imágenes del canal fotoconversión no es estrictamente necesario)
- Utilice el canal para obtener imágenes de la fluorescencia inicial con la exploración continua para ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector de la calidad de imagen óptima.
- Activar el canal fotoconversión y seleccione un láser de baja potencia. Inicio de una serie de imágenes lapso de tiempo y aumentar gradualmente hasta que el láser fotoconversión importantes de blanqueo de la fluorescencia inicial se observa. Continuar la exploración hasta la fluorescencia inicial es de aproximadamente 75% blanqueado.
- Desactivar el canal fotoconversión y activar el canal de detección de la fluorescencia photoconverted. Inicio de imagen con una ganancia del detector de alta y láser de baja potencia y poco a poco aumentar la potencia del láser hasta que la fluorescencia se detecta photoconverted. Una vez que detectan la fluorescencia photoconverted puede ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector de la calidad de imagen óptima.
- Por último, la potencia del láser utilizadopara fotoconversión, así como la duración de fotoconversión necesitan ser optimizados. El aumento de la potencia del láser fotoconversión se acelerará la tasa de fotoconversión, la potencia del láser sin embargo demasiada photobleach la proteína.
- Una vez que el poder fotoconversión láser óptima y la duración se han determinado, estos parámetros se pueden utilizar para configurar un módulo estándar o photobleaching FRAP y el "canal fotoconversión" ya no es necesario.
3. Doble óptica con la sonda destacando mOrange2 y Dronpa
Debido a la desplazada hacia el rojo propiedades espectrales, mOrange2 se puede utilizar en combinación con el verde Dronpa photoswitchable proteína fluorescente de doble sonda destacando óptico para permitir destacar selectiva de células individuales 4 (orgánulos) las poblaciones.
- Las células se cultivan en el fondo de cristal platos MatTek y transfectadas 24 horas antes de usar imágenes estándar Lipofectamine2000 transfección 1.
- Configurar el microscopio en busca de mOrange2 fotoconversión como se describe en la sección 2.
- Configurar el microscopio en busca de photoswitching Dronpa. Dronpa fluorescencia se pueden visualizar mediante el mOrange2 "canal fotoconversión" (véase el paso 2.2). (Nota: Reduzca al mínimo la potencia del láser utilizado para obtener imágenes de Dronpa, porque la potencia del láser demasiado hará que la inactivación de Dronpa.) Añadir un canal para la fotoactivación Dronpa. Usamos 800 nm de excitación de dos fotones para la fotoactivación, pero esta alternativa se puede lograr utilizando 405 nm de excitación. Determinar la potencia del láser necesaria para la imagen, foto-, y photoinactivation Dronpa de fluorescencia.
- Atención: fotoconversión de mOrange2 y la inactivación de Dronpa ambos ocurren a la excitación de 488 nm. Debido a la potencia del láser de alta necesaria para mOrange2 fotoconversión esto también inactivar Dronpa fluorescencia. Por otro lado, la inactivación Dronpa ocurre ya en la potencia del láser mucho más bajo y se puede realizar sin fotoconversión mOrange2 significativo.
- Una vez que los parámetros de fotoconversión mOrange2 y photoswitching Dronpa se establecen, destacando doble sonda óptica se logra a través de los siguientes pasos. En primer lugar, desactivar Dronpa fluorescencia en todo el campo de visión con nm de excitación de baja potencia 488. En segundo lugar, seleccione una región de interés y mOrange2 photoconvert con nm de excitación de alta potencia 488. Por último, seleccione una región de interés para activar Dronpa fluorescencia.
4. Resultados representante
Figura 1. Gota de preparación de la muestra. A) muestra correctamente preparados de gotas. B) muestra preparada sin recubrimiento de los portaobjetos de microscopio y cubreobjetos. C) muestra preparada sin la adición de 0,1% de BSA.
Figura 2. Efecto del poder fotoconversión láser y la duración de mOrange2 fotoconversión. Gotas único que contiene la proteína se mOrange2 photoconverted continuamente con diferentes cantidades de potencia del láser 488 nm. Potencia del láser utilizado para fotoconversión relativa fue del 10% (sólido), el 25% (línea discontinua), y el 100% (de puntos). A) naranja fluorescente especies. B) Photoconverted especie fluorescente de color rojo.
Figura 3. Doble óptica con la sonda destacando mOrange2 y Dronpa. Un celular) que expresa mOrange2-histona H2B y Dronpa Mito-antes fotoconversión, que presentan una fluorescencia de color naranja en el núcleo y la fluorescencia verde en la mitocondria. B) Dronpa fluorescencia se apaga con nm de excitación de baja potencia 488, lo que fotoconversión mínimo de mOrange2. C) mOrange2 se photoconverted a rojo con la excitación nm de alta potencia de 488. D) Dronpa fluorescencia se conecta de nuevo con 800 nm de excitación de 2 fotones. Los paneles son superposiciones de las imágenes de fluorescencia, junto con la imagen de contraste de interferencia diferencial.
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Discussion
La muestra purificada gota proteína fluorescente es un formato de muestra muy conveniente para la caracterización fotofísicas de proteínas fluorescentes, por ejemplo, para estudiar la cinética y la cinética de photobleaching fotoconversión. El volumen de gota muy pequeña (~ 20 picolitros) facilita photobleaching y experimentos fotoconversión, que puede ser difícil de realizar en los sistemas basados en la cubeta. Además, como se muestra aquí la muestra de gota es ideal para la creación de un microscopio confocal para aplicaciones fotoconversión. El recubrimiento hidrofóbico y la presencia de BSA son importantes para la obtención de gotas homogéneas. Sin recubrimiento de las gotas tienden a ser aplastado contra una de las superficies de cristal y en la ausencia de la proteína fluorescente BSA tienden a acumularse en la interfase 1-octanol/water, creando un halo de fluorescencia (Figura 1).
Fotoconversión proteína fluorescente es a menudo considerado como una alternativa para la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP), con la ventaja de que también se puede seguir la especie photoconverted. Sin embargo, es importante tener en cuenta que fotoconversión depende fundamentalmente de la potencia del láser utilizado. Demasiado poder fotoconversión láser o la exposición demasiado tiempo hará que en lugar de photobleaching fotoconversión, reduciendo así la cantidad de fluorescencia photoconverted (Figura 2).
Las propiedades desplazada hacia el rojo del espectro de mOrange2 y sus especies photoconverted permiso de doble sonda destacando óptico con un rotulador verde óptico fluorescente. Esto puede ser una proteína fluorescente photoswitchable (Dronpa), como se muestra aquí, o, alternativamente, una proteína fluorescente fotoactivables, por ejemplo, PA-GFP. Dronpa tiene la ventaja que se puede comprobar su presencia en el inicio del experimento. Por otro lado, el uso de Dronpa complica destacando óptica, ya que todos fluorescencia Dronpa tiene que ser inactivados en primer lugar, y el hecho de que Dronpa fluorescencia se apaga poco a poco durante la exploración. Estas complicaciones son menos profundas que el PA-GFP, pero la comprobación de la presencia de PA-GFP antes de fotoactivación puede ser más difícil.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Mike W. Davidson (Universidad Estatal de Florida) para proporcionar el plásmido de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM72048 (a DWP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microsope slides | VWR international | 48312-003 | |
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| methyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
