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免疫荧光法检测原代组织中的两种胸腺嘧啶类似物（CldU 和 IdU）

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DOI：

10.3791/2166

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2010年12月7日

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1Division of Endocrinology and Diabetes, Children’s Hospital of Philadelphia, Institute of Diabetes Obesity and Metabolism, Institute for Regenerative Medicine, Department of Pediatrics, University of Pennsylvania-School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们建立了一种策略，用于检测胸苷类似物（CldU和IdU）在成年小鼠组织中的顺序掺入，以量化连续两轮的细胞分裂。该策略适用于检测长寿命组织的细胞更新、致癌转化或过渡性增殖细胞。

摘要

准确测量细胞分裂是实验生物学中的一项基本挑战，尤其在分析缓慢分裂的细胞时，其复杂性日益增加。目前已建立的检测细胞分裂的方法包括：通过细胞培养中的连续显微观察进行直接可视化、使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）等活体染料的稀释法、免疫检测有丝分裂原性抗原（如ki67或PCNA），以及胸苷类似物标记法。胸苷类似物可通过多种方法进行检测，包括放射性检测（如氚标记胸苷）、免疫检测（如溴脱氧尿苷（BrdU）、氯脱氧尿苷（CldU）和碘脱氧尿苷（IdU）），以及化学检测（如乙炔基脱氧尿苷（EdU））。我们开发了一种策略，用于检测不同胸苷类似物（CldU和IdU）在成年小鼠组织中的顺序掺入。该方法使研究人员能够精确量化连续两轮的细胞分裂。通过优化免疫染色方案，我们的方法能够检测经饮用水给予的极低剂量胸苷类似物，且该给药方式对小鼠长期使用安全。因此，该技术可用于检测寿命极长组织中的细胞更新。在多种组织类型中均可获得理想的免疫荧光染色结果，包括胰腺、皮肤、肠道、肝脏、肾上腺、睾丸、卵巢、甲状腺、淋巴结和脑组织。我们还应用该技术识别组织内的癌变转化，并进一步用于确定过渡性扩增细胞是否参与组织的生长或更新。因此，顺序给予胸苷类似物代表了一种研究参与组织稳态的细胞来源与存活情况的全新方法。

方案

1. 使用CldU和IdU标记组织

  1. 将胸苷类似物（CldU 或 IdU）溶于水中。称取每种化学物质各 1 mg/mL，分别加入盛有蒸馏水的玻璃瓶中。我们通常每次配制 1 升。
  2. 使用磁力搅拌器或其他搅拌装置溶解化学物质。CldU 在室温下搅拌 10 分钟即可溶解。IdU 需要在 37°C 摇床中振荡超过 1 小时才能溶解。水源会影响 IdU 的溶解度。如果 IdU 在过夜振荡后仍未溶解，尝试更换更纯净的水源。溶液应置于 4°C 避光保存。
  3. 给予小鼠第一种含胸苷的溶液（CldU 或 IdU），持续所需的标记时间。在标记期间，禁止小鼠接触未标记的水。当指定的标记时间结束后，使用未标记的水进行至少 24 小时的洗脱期（含胸苷类似物的血清半衰期为数小时）。随后，给予小鼠第二种含胸苷的溶液（CldU 或 IdU），持续所需的标记时间。定期更换水瓶，防止小鼠脱水！
  4. 或者，可通过连续腹腔注射 CldU 和 IdU 对小鼠进行标记。将 CldU 或 IdU 配制成 10 mg/mL 的浓度。IdU 可能需要逐滴加入浓氢氧化钠溶液，随后剧烈振荡以形成悬浮液。切勿加入过量氢氧化钠。向 10 mL IdU 溶液中加入一滴氢氧化钠，然后在 37°C 摇床中振荡 1 小时。若仍未溶解，可重复加入氢氧化钠。按每克体重 100 mcg 的剂量注入腹腔。
  5. 本实验方案必须设置对照组切片。因此，我们强烈建议研究人员进行多种胸苷类似物标记方式，以确保检测的灵敏度和特异性。应包括以下几组：1. 仅用 CldU 标记的小鼠；2. 仅用 IdU 标记的小鼠；3. 先用 CldU 再用 IdU 顺序标记的小鼠；4. 反向顺序标记的小鼠，即先用 IdU 再用 CldU；5. 仅用纯水模拟标记的小鼠。在学习 CldU 和 IdU 标记技术时，研究人员应始终使用上述五种对照组切片，并对目标组织完成整个实验流程。

2. 组织采集、固定与切片制备

  1. 使用适当的麻醉剂，实施致死剂量后通过放血法处死小鼠。取出新鲜组织，并在4°C条件下用4%多聚甲醛固定24小时。将组织转移至1:4福尔马林缓冲液中，于4°C保存以备包埋。
  2. 或者，实施致死剂量后，经左心室向小鼠体内灌注生理盐水，直至血液完全清除；随后立即灌注30–50 cc的4%多聚甲醛。取出目标组织，并置于1:4福尔马林缓冲液中，于4°C保存以备包埋。
  3. 组织经脱水及石蜡包埋后，切取5微米厚的组织切片，并置于带电荷的载玻片上。将载玻片在65°C下烘烤16小时，以确保组织牢固黏附于载玻片（此步骤对后续抗原修复至关重要）。

3. 脱水、通透化与抗原修复

  1. 将切片浸入两缸二甲苯中各5分钟，以去除多余的石蜡。
  2. 用梯度乙醇水溶液对组织进行水化：依次为100%、95%、90%、80%、70%和50%。每种浓度浸泡3分钟，从100%开始，最终降至50%。
  3. 在1×PBS中洗涤切片5分钟。
  4. 将切片浸入0.2% Triton-X溶液中5分钟，以通透细胞（每次使用前新鲜配制）。
  5. 准备切片进行微波介导的组织抗原修复。将切片放入玻璃烧杯中，加入足量的0.01 M pH 6.0柠檬酸钠缓冲液，使液面高出切片顶部约5 cm，以补偿蒸发损失。
  6. 将切片微波加热至溶液沸腾（全功率下3–10分钟）。然后降低功率使溶液保持缓慢沸腾（10–80%功率），继续加热20分钟。定期检查微波炉，确保溶液持续缓慢沸腾。
  7. 将盛有切片的烧杯置于实验台面上，静置使其自然冷却至室温（约2小时）。
  8. 使用温度计确认切片已冷却至室温。
  9. 在室温下将切片浸入1.5 N HCl中40分钟。
  10. 用1×PBS洗涤切片两次，每次5分钟。

4. 一抗与二抗

  1. 在整个实验过程中，切片必须始终保持非常湿润。干燥的组织会产生更强的自发荧光，导致最终图像无法使用。为防止组织干燥，应一次只处理一张切片。
  2. 使用防液体扩散笔（例如蜡笔）在切片上圈出每个组织区域。将切片放回盛有1×PBS的容器中。
  3. 在密闭塑料容器底部平铺湿润的纸巾，制成一个湿盒孵育室。
  4. 配制封闭液：将10%驴血清用1×PBS稀释。必须用封闭液完全覆盖每个组织区域。对于1×1.5厘米的组织切片，每张切片使用50微升封闭液即可。
  5. 向切片中加入封闭液。将切片从1×PBS中取出，轻轻在干燥纸巾堆上轻敲切片边缘以去除多余液体。将切片放入孵育室中，向每个组织区域加入50微升10%封闭液。待所有切片处理完毕后，盖紧容器，并在室温下孵育1小时。
  6. 配制用于检测IdU的一抗稀释液。将小鼠抗BrdU抗体用含5%驴血清的1×PBS按1:250比例稀释。轻敲去除切片上的封闭液，将切片放回孵育室，向每个组织区域加入上述一抗溶液，并在4°C下孵育过夜。
  7. 配制高严谨性洗涤缓冲液（以最小化小鼠抗BrdU抗血清与CldU的非特异性结合）。新鲜配制低盐TBST缓冲液（36 mM Tris，50 mM NaCl，0.5% Tween-20；pH 8.0）。每对切片需40 mL缓冲液。将40 mL缓冲液加入每个50 mL锥形管中。在加入切片前，将溶液预热至37°C。
  8. 每次取出两张切片，从孵育室中取出后背对背放置（使组织面彼此相对），轻敲去除多余一抗。将切片放入装有低盐TBST的管中并盖好。在37°C、225 rpm条件下，于摇动式细菌培养孵育器中振荡孵育20分钟。
  9. 用新鲜1×PBS洗涤切片两次，每次5分钟。
  10. 如需检测CldU及组织抗原，配制下一组一抗溶液。将大鼠抗BrdU抗体用含5%驴血清的1×PBS按1:250比例稀释。将针对组织抗原的一抗按工作浓度加入该一抗溶液中。
  11. 轻敲去除切片上多余的1×PBS，将切片放入孵育室中。向每个组织区域加入一抗溶液，并在4°C下孵育过夜。
  12. 用新鲜1×PBS洗涤切片两次，每次5分钟。
  13. 配制二抗溶液。将Cy2标记的驴抗大鼠抗体和Cy5标记的驴抗小鼠抗体分别按1:250和1:500比例稀释于含5%驴血清的1×PBS溶液中。若需检测组织抗原的一抗来源物种，则加入Cy3标记的相应二抗。同时，将0.4 mg/mL的DAPI储备液按1:150比例稀释于二抗溶液中。
  14. 轻敲去除切片上多余的1×PBS，将切片放入孵育室中。向每个组织区域加入二抗溶液，在室温下孵育1小时。
  15. 用新鲜1×PBS洗涤切片两次，每次5分钟。
  16. 轻敲去除切片上多余的1×PBS，使用Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固（切勿使用Vectashield与花青类染料！）。轻压盖玻片以排除气泡。于4°C保存。

5. 成像与分析

  1. 使用配备高能光源、平场复消色差物镜和高效率显微相机（例如 Hamamatsu Orca ER）的荧光显微镜对目标组织进行成像。在 AMCA（DAPI）、Cy2（CldU）、Cy3（组织抗原）和 Cy5（IdU）通道中采集图像。合并图像以生成单个多层图像文件。
  2. 若操作正确，经 DAPI 染色的细胞核应呈现均匀明亮。组织抗原（例如胰岛素）染色应能显示目标细胞。如果 DAPI 或组织抗原染色较弱或不一致，可将切片浸入 1× PBS 中过夜以去除盖玻片，并重新施加二抗。
  3. 聚焦于 Cy3 通道中的组织抗原，通过切换通道检查 Cy2 和 Cy5 通道中的 CldU 与 IdU 染色情况。注意观察标记物之间是否存在潜在的交叉反应性，表现为 IdU 和 CldU 共定位信号过强。寻找仅含 CldU 或仅含 IdU 的组织区域。若缺乏 CldU 或 IdU 阳性细胞核，可能提示标记或染色过程中存在技术问题。此时可检查高增殖活性组织（如淋巴结）作为对照。
  4. 分析图像。显示包含 DAPI 和组织抗原的图层。用惯用手持白板笔，非惯用手持细胞计数器，用可擦写标记笔（即白板笔）在每个细胞核上做对比标记。计数目标组织内 DAPI 阳性细胞，记录总细胞数。使用白板擦清除所有标记。随后显示包含 DAPI、组织抗原和 CldU 的图层，计数目标组织内 CldU 阳性细胞，记录 CldU 细胞数，但暂不清除标记。切换显示内容以观察包含组织抗原、CldU 和 IdU 的图层，计数 CldU 与 IdU 双阳性细胞，记录数值后清除所有标记，再显示包含 DAPI、组织抗原和 IdU 的图层，计数目标组织内 IdU 阳性细胞总数，并记录 IdU 细胞数。

6. 代表性结果

我们对6周龄雌性小鼠先用CldU标记一周，再用IdU标记两周，随后立即处死。胰腺组织经染色以检测CldU、IdU和胰岛素（一种组织抗原），以及DAPI。胰岛均被胰岛素染色。CldU染色的细胞核与IdU染色的细胞核明显不同（图2）。胰岛外的许多细胞核同时呈CldU和IdU双阳性（图2，右下角，白色箭头）。单个胰岛素阳性细胞的细胞核同时显示CldU和IdU染色（图2，右下角，品红色箭头）。

小鼠。所有小鼠实验均按照费城儿童医院IACUC委员会的指南进行。雌性B6.129 F1野生型小鼠购自Taconic（Germantown, New York），饲养于费城儿童医院的实验动物设施中，并饲喂PMI Nutrition International（Richmond, Indiana）的Mouse Diet 5015小鼠饲料。

标记策略。通过使用CldU标记第一次细胞分裂事件（在本图示中以绿色表示），并使用IdU标记第二次细胞分裂（在本图示中以红色表示），连续的细胞分裂将产生同时被CldU和IdU标记的细胞（绿色/红色）。

小鼠胰腺细胞更新的胸苷标记代表性结果。显示小鼠胰腺组织的免疫荧光图像，其中胰岛位于中央。小鼠在立即处死前，先在饮水中连续灌注CldU持续1周，随后灌注IdU持续2周。胰腺样本按本方案所述方法进行处理。使用40倍物镜拍摄图像，具有清晰的分层结构，适合进行细胞计数。合并图像包含DAPI（白色）、CldU（绿色）、IdU（红色）和胰岛素（黄色）。（上左）DAPI与胰岛素；（上右）CldU与胰岛素；（下左）IdU与胰岛素；（下右）CldU、IdU与胰岛素。比例尺：100 μm。

CldU 和 IdU 掺入过程示意图，显示用于 DNA 复制分析的标记分布。
图 1. 标记策略。通过在第一次细胞分裂时使用 CldU（在本图示中以绿色标记）进行标记，第二次细胞分裂时使用 IdU（在本图示中以红色标记），连续的细胞分裂将产生同时含有 CldU 和 IdU（绿色/红色）的共标记细胞。

胰岛素与CldU/IdU在细胞簇中的免疫荧光显微镜图像；细胞增殖分析。
图2. 小鼠胰腺细胞更新胸苷标记实验的代表性结果。显示小鼠胰腺组织切片，其中央为胰岛结构。该小鼠在立即处死前，先在饮水中连续灌注CldU持续1周，随后灌注IdU持续2周。胰腺样本按本方案所述方法进行处理。图像使用40倍物镜拍摄，呈现清晰的分层结构，适合进行细胞计数。合并图像包含DAPI（白色）、CldU（绿色）、IdU（红色）和胰岛素（黄色）。（上左）DAPI与胰岛素。（上右）CldU与胰岛素。（下左）IdU与胰岛素。（下右）CldU、IdU与胰岛素。比例尺：100μm。

讨论

我们基于胸苷类似物标记细胞更新的方法在生物医学研究中具有多种潜在应用。迄今为止，我们的研究主要集中在胰腺，但也已将该策略应用于研究皮肤、肠道、肝脏、肾上腺、肾脏、睾丸、卵巢、甲状腺、淋巴结、造血系统以及脑组织的细胞更新1。由于不同组织间的细胞更新速率存在差异，因此应根据具体研究的器官定制标记策略，以获得最具说服力的数据。Morrison 及其同事采用 CldU 和 IdU 各标记 1 天的方法来研究造血过程2；Kuhn 及其同事则使用 CldU 和 IdU 各连续标记 4 天，以检测心肌再生过程中的细胞分裂3。相比之下，我们采用 CldU 和 IdU 总计长达 9 个月的标记方案，用于标记胰岛内基础水平的细胞更新，该组织在动物衰老过程中细胞更新极为缓慢1,4-6。我们标记策略最明显且直接的应用是用于定义组织稳态中的细胞更新研究。但该技术还具有其他多种潜在应用。例如，我们最近还将此技术用于识别组织中的癌性转化，其中局部增殖活性增强的区域可通过 CldU 或 IdU 掺入量的增加而被清晰识别5。Morrison 及其同事使用 CldU 和 IdU 各标记 1 天的方法，检测造血干细胞的标记保留特性2。我们还应用连续胸苷类似物标记法，以确定迁移扩增细胞是否参与组织的生长或更新1。在此类应用中，胸苷类似物的序贯给药为研究参与组织稳态的细胞起源及其存续提供了新颖的方法。

使用胸苷类似物时应谨慎。合成的胸苷类似物可能对分裂中的细胞具有毒性，理论上可能损害生长中动物的细胞更新。胸苷类似物曾被用作癌症患者的放射增敏剂，可能会减缓细胞更新。因此，我们建议研究人员在感兴趣的组织中谨慎评估其潜在毒性。例如，Trumpp 及其同事发现，全身性使用 BrdU 可促使造血干细胞进入细胞周期7。又如，Rutter 及其同事观察到高剂量的胸苷类似物对发育中的胰腺具有毒性8。最近，KineMed 公司的 Hellerstein 及其同事利用专有的重水标记技术发现，BrdU 的给药可使胰岛内细胞增殖减缓 16–25%9。Hellerstein 及其同事所使用的完整胰岛样本中包含大量其他内分泌和非内分泌细胞类型，这些细胞可能占胰岛总制备物的 50%。然而，我们发现，在年轻成年小鼠中，长期输注 BrdU 并不影响 β 细胞的增殖，该结论基于 ki67 表达水平的测定4。类似地，长期给予 CldU 和 IdU 似乎也不会损害 β 细胞质量的扩展1。此外，长期使用 BrdU 标记的小鼠与仅标记数小时的小鼠相比，其 β 细胞增殖率相当（增殖率已归一化至相同的时间段）。综合这些结果表明，小鼠能够安全耐受长期低剂量的胸苷类似物给药。尽管如此，我们仍不能排除胸苷类似物对胰腺 β 细胞生长可能存在的毒性作用。因此，我们在使用胸苷类似物标记小鼠时仍持续设置对照，并建议其他研究人员也采取相同做法。

我们的连续胸腺嘧啶类似物标记技术并非没有缺陷和技术挑战。因此，对照切片尤为重要。我们制备了包含以下各种组织的对照切片：1）仅用CldU标记的小鼠组织；2）仅用IdU标记的小鼠组织；3）先用CldU、再用IdU顺序标记的小鼠组织；4）标记顺序相反，即先用IdU、再用CldU顺序标记的小鼠组织；5）仅用生理盐水模拟标记的小鼠组织。在学习使用CldU和IdU进行标记时，研究人员应始终对上述五组感兴趣的组织切片完整执行整个实验流程。

CldU 与 IdU 之间存在轻微的交叉反应性，这是使用这两种胸苷类似物进行标记时不可避免的缺点。CldU 和 IdU 技术基于针对 BrdU 在不同物种（小鼠和大鼠）中产生的抗血清之间亲和力的差异。尽管我们的方案较为繁琐，但其设计旨在最大限度地减少此类交叉反应。因此，我们强烈建议考虑省略该方案中一个或多个步骤的研究人员务必谨慎。特别是，我们曾遇到过某些二抗抗血清在小鼠与大鼠之间存在交叉反应的问题。使用经过小鼠与大鼠之间完全交叉吸附处理的 Jackson 抗血清可有效降低此类问题。

我们偶尔会无法充分检测到胸腺嘧啶核苷的掺入。在这种情况下，使用阳性对照切片来确定哪个试剂或步骤失效至关重要。问题通常源于抗血清分装物质量不佳、切片干燥或细胞核通透不充分。我们曾未能成功标记发育中的胚胎中的IdU。因此，并非所有组织都对IdU具有通透性。

用于双胸苷类似物标记的CldU和IdU替代方案正在出现。EdU（5-乙炔基-2-脱氧尿苷）可作为铜催化“点击化学”检测的底物10,11。EdU的检测方法无需DNA链的解离，因此非常适合流式细胞术分析12。EdU与BrdU兼容，但无交叉反应性10。EdU已被用于定量多种小鼠组织的细胞更新，包括胰腺β细胞13、肠道L细胞14和表皮15。目前EdU的价格相对较高（每500 mg约1000美元）。然而，EdU检测的灵敏度似乎远高于BrdU检测10。因此，联合使用EdU和BrdU可能在经济上是可行的，可替代CldU和IdU。该方法还可能实现对三重标记EdU、CldU和IdU的小鼠中三种不同细胞分裂周期的检测。

总之，我们采用的连续胸腺嘧啶类似物标记技术是一种检测细胞更新的创新方法。我们希望该方法能够帮助其他科学家更准确地量化细胞分裂，并有望为组织稳态研究开辟新的范式。

披露

所有小鼠实验均在费城儿童医院的动物实验中心按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。

致谢

由JDRF、美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R01-DK081469）、宾夕法尼亚州（再生医学卓越中心资助项目编号4100043362）、美国出生缺陷基金会（Basil O'Connor 新兴学者研究奖）以及宾夕法尼亚大学DERC试点与可行性资助项目（DK19525）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-氯-2-脱氧尿苷 (CldU)MP Biomedicals0210547891
5-碘-2-脱氧尿苷 (IdU)MP Biomedicals0210035701
4% 多聚甲醛USB Corp., Affymetrix19943
10% 缓冲福尔马林赛默飞世尔科技23-427-098
二甲苯VWR internationalEM-XX0060-4
无水乙醇（组织学用）赛默飞世尔科技A405P-4
PBS，10X 粉末浓缩液赛默飞世尔科技BP665-1
吐温-100 –X-100赛默飞世尔科技BP151-500
盐酸VWR internationalBDH3028-2.5LG
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-121
小鼠抗 BrdU 抗体BD Biosciences347580
大鼠单克隆抗体抗 BrdUAccurate Chemical & Scientific CorporationOBT0030
Cy2 标记驴抗大鼠二抗Jackson ImmunoResearch712-225-153使用 Jackson 提供的完全吸附二抗（交叉反应性最低）。
Cy5 标记驴抗小鼠二抗Jackson ImmunoResearch715-175-151参见上文
玻璃盖玻片Sigma-AldrichC9056-1CS
YFP 滤光片Chroma Technology Corp.49003 ET EYFP降低 Cy2 通道的自发荧光
Cy3 滤光片Chroma Technology Corp.49004 ET Cy3
Cy5 滤光片Chroma Technology Corp.49006 ET Cy5
ORCA ER 显微镜相机Hamamatsu Corp.C4742-95-12ER对荧光染料具有优异的检测能力
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930请勿使用 Vectashield（对花青类染料有毒性）。

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Cldu Idu

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