Summary
적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
등온 적정의 열량 (ITC)는 구속력있는 반응의 전체 열역학적 그림을 이해하기위한 유용한 도구입니다. 생명 공학, macromolecular 상호 작용은 세포의 기계를 이해 필수적입니다. 이러한 버퍼 및 온도와 같은 실험 조건, 연구중인 특정 바인딩 시스템에 맞출 수 있습니다. 특정 리간드와 macromolecule 농도 범위가 유용한 데이터를 얻기 위해 필요한 때문에 그러나, 신중한 계획이 필요합니다. macromolecule과 리간드의 농도는 정확하게 신뢰할 수있는 결과를 결정해야합니다. 관리는 또한 불순물이 상당히 실험에 영향을 미칠 수있는 샘플을 준비할 때 이동해야합니다. 같은 stoichiometry, 친화력 및 엔탈피와 같은 컨트롤과 함께 ITC 실험은, 제대로 수행하는 유용한 바인딩 정보는 얻을 수 있습니다. 다른 버퍼 또는 온도 조건 하에서 추가적인 실험을 실행하여, 자세한 정보는 시스템에 대한 구할 수 있습니다. ITC 실험의 기본 설정을위한 프로토콜이 제공됩니다.
Protocol
등온 적정의 열량 (ITC는) 1 실험에 바인딩 상호 작용의 모든 열역학적 파라미터를 (친화력, 엔탈피 및 stoichiometry)를 확인할 수 있습니다 잘 구축 기법입니다. 1 ITC는 등온 조건에서 두 번째 반응물 하나의 반응물을 titrating으로 작동합니다. 측정된 신호는 두 reactants의 상호 작용 (결합)에 따라 공개 또는 흡수 열 수 있습니다. 주사 일련의이 수행되고 제한 반응물이 포화되면서 열 신호가 제로 접근합니다. 등온의 피팅은 열역학적 파라미터를 제공합니다. 여러 리뷰 계측뿐만 아니라 데이터 수집 및 분석의 수학을 설명하는 것이 가능합니다. 2,3 다른 calorimeters를 사용할 수 있지만 (특히 작은 볼륨으로 ITC 200), 여기서 우리는 VP - ITC에 대한 일반적인 프로토콜을 제작 설명 MicroCal로 (현 GE 헬스케어의 일부).
1. 준비 샘플
- 버퍼에 macromolecule와 리간드를 준비하기 위해 몇 가지 잠재적인 문제가 해결해야합니다. 정확한 맞는가 macromolecule의 적절한 농도, 일반적으로 샘플 ITC의 세포와 리간드에서 통용되는 종, 사출 주사기에 수종이 필요합니다. 어떤 단백질은 사출 주사기의 수종에 필요한 높은 농도에서 집계하기 때문에, 대부분 단백질은 샘플 셀로로드됩니다. 최적의 macromolecule 농도는 ITC를 사용하기 전에 직교 방법을 사용하여 예상 수있다 "C", 시스템의 예측 친화력의 제품, 그리고 전체 macromolecule 농도에서 결정된다 여기서 C = K * [M]. 10-1000, 1 C 범위의 최적 가치가 낮은 한도 이하로 C - 가치관과 구체적인 실험 조건 약한 결합 시스템에 대한 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다하지만. 따라서 4, macromolecule 농도는이 범위를 함께 결정되어야합니다 마음에 C 값 (즉, K에 대해 10 6 M -1이, 10-1000 μm의 macromolecule의 농도를 사용해야합니다.) 시스템의 바인딩 친화력의 사전 지식은 ITC의 실험의 더 나은 디자인을 통해 ITC에 사용되는 단백질을 최소화 도움이 될 수 있습니다. 그 채도가 적정의 절반을 가장 먼저 셋째 내에서 발생 때문에 리간드의 농도는 (약한 리간드 바인딩 사이트에 대한 K D보다 더 집중적으로 7-25 배) 정도로 커야합니다. 데이터의 정확한 피팅은 또한 신호의 채도를 필요로합니다. 높은 바인딩 친화력있는 시스템의 경우, 낮은 리간드 농도가 정확하게 맞는를 줄 것이다있는, 너무 일찍 적정의 채도를 방지하는 데 사용해야합니다. 일단 희석 컨트롤의 열 (버퍼로 리간드의 즉, 적정)가 적정에서 빼는되었습니다, 채도의 엔탈피는 제로 접근해야합니다.
- 작은 분자 불순물이 ITC 측정에 artifactual 신호 상승을 줄 수 있기 때문에, 그것은 macromolecule와 리간드가 철저하게 버퍼에 대한 dialyzed하는 것이 가능하면 좋습니다. 또는, 칼럼 크로마 토그래피, 스핀 컬럼을 탈염, 또는 버퍼 교환 원심 필터 (예를 들어, Centricons)은 macromolecule의 버퍼를 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 리간드는 작은 분자있다면, 그것은 macromolecule가 (스펙트럼 / 포 플로트 - A - Lyzer에 대한 즉, 100-500 다 작은 분자에 적합한 단절과 투석 점막에 대한 dialyzing에 의해 dialyzed 또는 이후 투석 버퍼를 사용하여 준비할 수 ). 리간드와 macromolecule 솔루션 사이의 버퍼 구성의 차이는 샘플의 불순물의 희석의 더위에서 유물을 신호로 이어질 수 있습니다. 준비 후, 엔탈피의 유물로 버퍼, macromolecule 및 리간드와 일치의 PH (± 0.05 산도 단위)가 protonation 효과를 버퍼로 인해 발생할 수 있는지 확인하십시오. 5 각 종 충분한 준비를해야합니다. 세중의 실험과 희석 제어, 필요한 자료의 금액은 사용 ITC에 따라 달라집니다. 그러나, 대략 2 ML 볼륨 샘플 세포를 대부분 ITC기구, macromolecule 솔루션의 적어도 6-7 ML이 필요한 것이며, 편리한 15 매 ML 튜브에 준비하실 수 있습니다. 300 μL 주입 주사기 들어, 솔루션 1-2 ML은 충분해야하고, 팔콘 튜브 또는 microcentrifuge 튜브 하나에 준비하실 수 있습니다.
- 먼지 및 기타 입자는 ITC의 열상의 기준에 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 그것은 그들이 실험을 실행하기 전에 제거하는 것이 필수적입니다. 샘플 주식 솔루션의 준비 후, 샘플이 8000에서 솔루션에 펠렛 입자에 14,000 RPM으로 5 분 동안 microcentrifuge 튜브에 centrifuged해야합니다. , 뜨는을 제거 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 그리고 새로운 매 / microcentrifuge 관에 놓으십시오.
reductants이 감소 cysteines를 유지하는 데 필요한 경우, β - merca의 낮은 농도와 신선한 주식을 사용하여ptoethanol, TCEP (트리스 (2 - 카르 복실) phosphine) 또는 dithiothreitol이 reductant 산화로 인해 어떤 유물을 최소화하기 위해. 또한, 버퍼에 유기 용제의 존재는 (용해되기 위해서는 메탄올이나 DMSO가 필요할 수 있습니다 몇 가지 작은 분자 리간드에 대한 일반) 신호 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 유기 용제는 리간드에 필요한 경우 다음 macromolecule 솔루션은 또한 유기 용매의 희석의 열을 발생하는 모든 신호를 피하기 위해 같은 농도를 포함해야합니다. 리간드와 cosolvents로 인해 macromolecule 사이의 버퍼 구성에 약간의 차이는, 염분이나 산도는 시료의 준비 기간 동안 가능합니다. 이것은 버퍼 내용의 차이에서 발생하는 열 신호가 전적으로 유물에서 발생하는 데이터를 발생하지 않도록 macromolecule에 샘플 버퍼 또는 샘플 버퍼에 리간드의 희석을 확인하는 것이 좋습니다. - 신중하게 자신의 정확한 농도를 기록하는 시스템에 적합한 기술 (예 : 흡광도 측정, HPLC, colorimetric assays, 단백질에 대한 BCA의 assays 등)를 사용하여 macromolecule과 리간드의 농도를 확인합니다. 실제 농도와 등온에 맞게 사용 농도 차이는 stoichiometry, 엔탈피 및 실험에서 결정 바인딩 친화력에 오류가 발생할 것입니다. 그것은 특히 높은 온도에서 공기 방울이나 적정 중에 녹아 가스의 출시로 인한 신호 유물을 피하기 위해 데가스 샘플에 일반적입니다.
2. 실험 설정
- 샘플 셀 및 주입 주사기는 macromolecule와 리간드를 로딩하기 전에 제조 업체의 프로토콜에 따라 청소 있는지 확인하십시오. 해밀턴 주사기 (총신 쉽게 고장으로 해밀턴 주사기 또는 바늘을 구부리고 치료를 사용)를 사용하는 증류수의 1.8 ML로 샘플 셀에게 두 세 번 씻어. 다음 버퍼의 1.8 ML로 샘플 셀 여러 번 씻어. 거품 형성을 피하기 위해주의되는, macromolecule 솔루션 1.8 ML로 샘플 셀을로드합니다.
- 증류수로 참조 셀을 채웁니다. 대부분의 버퍼 경우, 증류수는 참조 솔루션으로 사용 괜찮아요. 그러나, 특히 높은 이온 강도 또는 osmolality와 버퍼를 위해, 이것은 참고로 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다.
- 해밀턴 주사기를 사용하여 참조 및 샘플 세포에서 기포를 제거합니다. 부드럽게 세포의 하단에하고 세포의 상단에 잘 연결된 수있는 거품을 두드리는 세포의 측면 상하 주사기의 바늘을 이동합니다. 샘플 및 참조 세포에서 초과 볼륨을 제거합니다.
- 튜브를 사용하여 사출 주사기의 입력 포트에 플라스틱 주사기를 첨부하십시오. 증류수로 분사 주사기 린스. 버퍼 린스로 따르십시오. 사출 주사기 완전히 시스템을 통해 공기를 그림으로써 철수 있는지 확인하십시오. 전체 주사기가 가득 때까지 리간드 솔루션에 분사 주사기의 바늘을 놓고 사출 주사기로 리간드 솔루션을 그립니다. 항구와 연결된 튜브에 약간의 여분의 볼륨을 (약 50 μl 이상) 도면 계속합니다. 즉시 주사기의 입력 포트를 닫고 튜브 및 플라스틱 주사기를 분리합니다. 주사기에서 모든 거품을 제거하는 정화 및 리필 사출 주사기 두 번 더. 리간드 솔루션에서 주사기를 제거하고 이것은 주사기에서 볼륨을 제거할 수로 kimwipe에 주사기 팁 만지지 않도록 조심하고, 어떤 방울을 제거하는 kimwipe과 측면을 닦아 내십시오. 또한,이 또한 주사기 팁에서 볼륨의 손실을 일으킬 수있는 주사기를 노크 또는 병 않도록주의합니다. 샘플 세포에 주입 주사기를 놓습니다.
- ITC를 실행하기위한 매개 변수를 설정합니다. 강력한 열 신호 바인딩 시스템에 낮은 볼륨 주사의 많은 수의 피팅에 대한 더 많은 데이터 포인트 (3 μl의 예 : 75 주사)를 제공합니다. 약한 열 신호를 가지고 시스템을위한, 큰 볼륨 주사의 소수 (8 μl의 예 : 33 주사) 바람직합니다. 가장 일반적으로 높은 사출 볼륨과 적은 주사이 사용됩니다. 그것은 여러분의 시스템에 가장 적합한 조건을 최적화하기위한 몇 가지 titrations 걸릴 수 있습니다. 바인딩 엔탈피 역시 연구되고있는 시스템에 따라, 발열 또는 흡열 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 불행히도 어떤 시스템은 결정하기 위해 반응의 열기가 어렵게 낮은 열 신호를합니다. 이러한 시스템과 문제가 잠재적으로, macromolecule의 농도를 증가 실험 (바인딩 시스템의 열 용량에 따라), 그리고 /의 온도를 변경하거나 산도 또는 버퍼의 이온 강도를 변경하여 극복할 수 있습니다.
- 또한 각 주사 사이의 시간 간격을 고려하십시오. 그것은 리간드의 각 주입 후, 시스템이 평형 시간이 주어집니다 것이 필수적이며 다음 주입이 발생하기 전에 열 신호가 기준으로 돌아갑니다. 대부분의 시스템, 3-5 마일을 위해nutes 충분해야합니다. 주사 사이의 시간은 평균 5 분 이내에 발생하지 않습니다 시스템에 대한 증가한다.
- 그것이 샘플 세포에 삽입되면 사출 주사기에 macromolecule와 리간드 솔루션 사이 혼합있을 것입니다 때문에, 첫 번째 주사는 가짜 결과를 줄 것이다. 이것은 첫 번째 또는 두 주사 (그래서 그들은 나중에 삭제 가능)에 대한 작은 볼륨 (예 : 2 μl)을 사용하여 원하는 값을에서 후속 주사를 유지하는 것이 좋습니다.
- 실험의 온도 (25 ° C 2와 80 사이의 기온 ° C를 사용할 수 있지만, 가장 일반되는).를 선택하세요 리간드 - macromolecule 시스템에서 수행된 다른 실험 (구속, 운동 등)에 맞는 온도를 선택하는 것이 좋습니다. ITC는 실험의 온도와 다른 온도에서 평형까지 설정할 수 있습니다. 실험이 10 개 이상 ° C 떨어진 상온에서 온도에서 수행 될 경우, 다음 5에 포함된 악기 ° 실험 온도의 C에 대한 평균 온도를 설정하는 것이 좋습니다. 이 악기는 실험 온도에 도달하는 데 걸리는 시간을 줄일 수 있습니다.
주사기의 교반 속도도 고려되어야합니다. 감동은 적정 동안 리간드와 macromolecule의 적절한 혼합에 필요한 있지만, 일부 단백질은 빠른 교반에 의해 불안 정한됩니다. 이런 경우, 교반 속도는 상대적으로 낮은 속도로 설정해야합니다. 일단 모든 실험 매개 변수는 다음 실험을 시작할 수 있습니다, 설정되었습니다. - 실험이 완료되면, ITC는 제조 업체의 프로토콜에 따라 청소하실 수 있습니다. macromolecule - 리간드 복잡한 혼합물에 대한 추가 실험이 원하는 경우에는 실험의 끝에 샘플 세포의 솔루션은 보관하실 수 있습니다.
- titrations에게 재현성 데이터를 얻을 적어도 한 두 번 더 반복합니다. 리간드는 리간드에 대한 희석의 더위를 결정하는 샘플 셀에 버퍼로 titrated되는 컨트롤을 실행합니다. 바인딩 프로세스에 대한 협력 구속력 추가 정보가 어떤 시스템에 대한 리간드로 macromolecule를 주사하여 얻은 수 있습니다. 다른 분사 방향은 세계적인 피팅을 위해 도움이 될 수있는 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 6
3. 데이터 분석
- 데이터 피팅 쉽게 데이터 피팅 프로그램 (일반적으로 악기와 함께 제조 업체에서 제공)에 매크로를 사용하여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 데이터 파일을로드합니다. 신호에 공기 방울이나 기타 유물의 흔적을 그대로 열상을 확인합니다. 어떤 유물들이 (예 : 그 시점에서 더 주입이 없었 기준이나 봉우리에서 스파이크 등)가있다면 그들은 제거되어야 겠지만, 그렇게되면 이러한 데이터 포인트를 기록해 둡니다. 다음 리간드 희석 제어 데이터를로드하고, 바인딩 등온에서 리간드 희석 데이터를 뺍니다. 이때 희석 아티팩트가 발생 적정의 첫 번째 또는 두 개의 데이터 포인트 (7 단계 참조)를 포함하여 모든 가짜 데이터 포인트를 제거합니다.
- 데이터를 맞게하는 데 사용할 데이터 피팅 모델 (한 구속력이 사이트를 두 / 다중 바인딩 사이트, 협동 바인딩 등)을 선택합니다. 데이터는 (K) 피팅 매개 변수, stoichiometry (N), 엔탈피 (ΔH)와 바인딩 친화력의 초기 추측에 맞게 수 있습니다. 바인딩 친화력, 또는 다른 매개 변수의 사전 지식, 직교 실험에서 알려져있다면,이 값을 입력할 수 있습니다. 이것은 맞는 동안 지역 minima에 갇혀되는 발작을 방지하는 데 도움이됩니다. 데이터가 처음으로 적정에 맞는되었습니다되면, 등온선의 나머지 단계 15, 16를 반복합니다. 또는 데이터가 전 세계적으로 같은 SEDPHAT 같은 프로그램을 사용하여 들어갈 수 있습니다 6. SEDPHAT가 셋으로 이루어지는 복잡한 데이터 세트와 함께 바이너리 복잡한 데이터 세트 (즉, 분자 A + B)의 글로벌 피팅 특히 도움이 될 수있다 (분자 A + B + C). 예를 들어, AB 복합 분자 C의 결합에서, 그것은 (가 완전히 포화되지 않은 경우)로 A 또는 B의에 C의 바인딩으로 인한 신호가있을 수도 있습니다 여부를 항상 명확하지 않습니다.
- ITC 데이터 artifactual되지 않도록하려면 바인딩 친화력과 ITC에서 얻은 stoichiometries은 직교 방식과 비교해야합니다. 또한 7,8, ITC의 엔탈피 값을 van't 호프 플롯에서 엔탈피 비교할 수 있습니다. 9 또한 열 신호의 절대값이 증가 macromolecule 농도로 증가한다 같이 리간드 또는 macromolecule의 다른 농도를 사용하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유물은 세포와 주사기에있는 버퍼가 일치되지 않을 경우 발생할 가능성이 가장 높은 수 있습니다. 유물에 대한 또 다른 가능성은 불순한 샘플에서 발생한다.
- 우리는 K D와 stoich에서 제공 이전에 정보가있는 사용자가 간단한 이진 복잡한 titrations 시작하는 것이 좋습니다iometry. 그런 다음, 추가 리간드가 구속 경우, 사용자는 리간드의 농도 변화, 더 복잡한 3 원 콤플렉스 titrations을 시도 수 있으며, 아마도 주사기와 세포 구성 요소를 전환합니다. 엔탈피는 상태 함수이므로 셋으로 이루어지는 복잡한 형성하는 두 경로에 대해 enthalpies의 비교 첨가제해야합니다. 10 다시, SEDPHAT 6 여기에 꽤 도움이 될 가능성이 높습니다.
4. 대표 결과 :
그림 1. E.에 cofactor NADPH의 바인딩에 대해 잘 행동 적정의 대표 예 대장균 염색체 dihydrofolate 환원 효소 (ecDHFR). 패널 (A)는 원시 열상을 보여줍니다, (B), 통합 열상에 맞는에서 바인딩 등온선은 기원 소프트웨어의 한 사이트 모델을 사용하며, (C) 등온의 적합 따라 SEDPHAT에서 한 바인딩 사이트 모델을 사용 맞는 residuals과 함께. 기원 소프트웨어에서 하나의 사이트 바인딩 모델을 사용, N = 1.09 ± 0.02, K D = 0.194 ± 0.001 μm의, ΔH = -22.7 ± 0.4 kcal / 몰, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal / 몰, 및 ΔG = - 9.16 ± 0.01 kcal / 몰. Sedphat은 0.94의 N 여유가 사용하는 데이터의 적합한 ± 0.01, 0.195의 K D ± 0.013 ΔM, -22.5의 ΔH ± 0.2 kcal / 몰, -13.39의 TΔS kcal / 몰 및 -9.15 kcal / 몰의 ΔG.
Discussion
ITC 12 DNA - 리간드 13 RNA - macromolecule 14 연구, 단백질 - 리간드를보고 연구에 리간드 macromolecule 상호 작용, 11 공부에 광범위하게 사용되고 있습니다. ITC는 심지어 유니폼 suspensions을 형성 등 nanoparticles과 같은 고체 재료, 함께 실행할 수 있습니다. 나아가 15, 하나 리간드가 이미 macromolecule에 바인딩하고 두 번째 리간드가 titrated는 3 원 시스템,의 열역학을 결정하는 데 사용할 수에 대한 예를는 효소 - cofactor 시스템 기판의 결합. 7 연구하는 것은 또한 일반적으로 약한 결합 리간드와 경쟁 바인딩 assays를 수행하여 ITC의 검출 한도를 초과 매우 높은 바인딩 동질성과 분자에 대해 수행할 수 있습니다. 약하게 구속 16 정보 리간드 또한 경쟁 assays에 의해 얻을 수 있습니다. 17이 바인딩에서 물의 역할은 용매 개편에 대한 엔탈피의 의존도와 함께 ITC, 18으로 살펴 수 있습니다. 최근에는 19, DNAK 변종의 conformational 변화의 열역학은의 바인딩에 따라 측정되었다 바인딩 엔탈피에 ADP와 ATP. 20 단백질 - 단백질 협회는 이종의 단지 21뿐만 아니라 게이 협회에 관한 정보를 항복, ITC에서 공부하실 수 있습니다. 22 온도 효과는 바인딩 이벤트의 열 용량을 제공합니다. 2 번호를 추가 ITC 연구는 다른 산도 값에서 수행하는 경우에는 양자가 흡수하거나 바인딩에 출시도 이온화의 다른 enthalpies와 버퍼에서 수행 실험에서 확인할 수 있습니다. 5 다음 관련 그룹의 pKa는 잠재적으로 결정하실 수 있습니다. 23
요약하면, macromolecule과 리간드의 농도의 정확한 측정 좋은 ITC 실험을 위해 필수적입니다. 샘플 농도는 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수있는 적절한 범위 내에서해야합니다. 작은 분자의 불순물과 산도의 불일치는 열상의 아티팩트의 원인이되므로주의가 버퍼로 이동한다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF 교부금 MCB - 0817827에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-282 | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 2.5 mL Hamilton syringe | MicroCal | SYN161714 |
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