肌醇焦磷酸盐在癌症、糖尿病和肥胖等人类病理过程中发挥着重要作用；然而，其确切的作用机制仍存在争议。由于 commercially available 的肌醇焦磷酸盐缺乏，导致深入研究变得困难。本文介绍一种简单的方法，用于制备和分离毫克级的肌醇焦磷酸盐。
本文内容
摘要
摘要
肌醇在自然界中以未修饰形式或更复杂的磷酸化衍生物形式存在。其中，在真核细胞中含量最丰富的两种衍生物是五磷酸肌醇（IP5）和六磷酸肌醇（植酸或IP6）。IP5和IP6是含一个或多个焦磷酸键的肌醇焦磷酸分子的前体1。IP6的磷酸化可生成二磷酸五磷酸肌醇（IP7或PP-IP5）和双二磷酸四磷酸肌醇（IP8或(PP)2-IP4）。迄今为止，所有已研究的真核生物中均分离出了肌醇焦磷酸。此外，负责肌醇焦磷酸合成的两类不同酶在进化过程中高度保守2-4。
IP6激酶（IP6Ks）具有极强的催化灵活性，可将IP5和IP6分别转化为PP-IP4和IP7，并进一步以这些产物为底物，促进更复杂分子的生成5,6。最近，另一类可生成焦磷酸盐的酶被鉴定出来，即酵母蛋白VIP1（也称为PP-IP5K），该酶能够将IP6转化为IP7和IP87,8。
肌醇焦磷酸盐调控多种不同的细胞过程，如胰岛素分泌9、端粒长度10,11、趋化性12、囊泡运输13、磷酸盐稳态14以及HIV-1 gag释放15。针对这类分子的作用机制已提出两种假说：它们可通过变构方式与特定蛋白质（如AKT16）相互作用从而影响细胞功能；或者，焦磷酸基团可将磷酸基团转移至预先磷酸化的蛋白质上17。然而，由于目前尚无商业来源的肌醇焦磷酸盐，该研究领域巨大的潜力受到限制，许多科研人员因此难以开展对这些分子及这种新型翻译后修饰的研究。现有用于分离肌醇焦磷酸盐的方法需要复杂的色谱设备18,19，且这些方法使用酸性条件，可能导致肌醇焦磷酸盐降解20，从而降低回收率。此外，繁琐的柱后脱盐步骤也限制了这些方法仅能在专业实验室中应用。
本研究描述了一种简便的方法，用于生成、分离和纯化IP6-激酶和PP-IP5-激酶反应的产物。该方法得以实现，得益于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）能够有效分离高度磷酸化的肌醇多磷酸盐20。在以IP6为底物进行IP6K1和PP-IP5K酶促反应后，采用PAGE分离生成的肌醇焦磷酸盐，并随后用水洗脱。
方案
1. 酶促反应 - 第1天（下午1小时）
- 第一步是制备10-20个独立的酶促反应，其中IP6K1或VIP1将IP6转化为焦磷酸化异构体。
- 我们使用根据先前报道的方法从E. coli中纯化的His-IP6K1和GST-Vip1酶17,18。
- 配制50 μL反应体系，包含1X反应缓冲液（30 mM Hepes pH 6.8、50 mM NaCl、6 mM MgSO4、1 mM DTT）、6 mM磷酸肌酸（PCr）、25 U/mL肌酸磷酸激酶（CPK）、5 mM ATP（Mg盐）、0.3 mM IP6以及0.05–0.1 μg His-IP6K1或GST-Vip1，用MiliQ ddH2O补足体积。
- 短暂离心反应管，并在37°C下旋转孵育过夜。
2. 聚丙烯酰胺凝胶的制备与上样 - 第2天（下午4小时）
- 使用24 cm长、18 cm宽的玻璃板和1.5 mm宽的垫片制备聚丙烯酰胺凝胶。通常使用16孔或制备用的单孔梳子。
- 配制混合液（每块凝胶50 mL），包含以下成分：35.5% (w/v) 丙烯酰胺:双丙烯酰胺（19:1）、1X Tris/硼酸/EDTA（TBE）、0.05% (w/v) 过硫酸铵（APS）、0.05% (w/v) 四甲基乙二胺（Temed）。将混合液倒入预制的玻璃板之间，插入梳子，并在室温下聚合30–60分钟。
- 凝胶聚合完成后，将装置转移至冷室，在1X TBE中以200–300伏电压预电泳约30–60分钟。
- 向每个反应体系中加入1X的橙G染料（10 mM Tris-HCl pH 7.0、1 mM EDTA、30%甘油、0.1%橙G）。准备一个含有2 nmol IP6 的样品作为标准对照上样。
- 使用注射器和21G针头，用电泳缓冲液彻底冲洗每个加样孔，以去除任何沉淀物，然后上样。避免在两侧的孔中加样。
- 以450–550伏电压（每块凝胶7 mAmp）过夜电泳，直至橙G染料条带迁移至凝胶底部最后10 cm范围内。
3. IP7 的分离——第3天（4小时）和第4天（6-7小时的SpeedVac干燥过程）
- 拆卸凝胶装置，小心取下一块玻璃板，使凝胶保留在另一块玻璃板上。从橙色G染料条带上方至底部切下一小部分凝胶，包含IP6 标准品及一个样品泳道，如图1所示。
- 用甲苯胺蓝染色液（0.1% (w/v) 甲苯胺蓝，20% (w/v) 甲醇，2% (w/v) 甘油）对切下的凝胶部分染色数分钟（1–3 分钟），直至肌醇焦磷酸条带显现。将先前取下的玻璃板重新盖在凝胶上方，以防止未染色的凝胶干燥。
IP7 条带应可见，因其迁移速度略慢于免疫沉淀产物6 标准。ATP 的迁移速度比 IP 快6，也应可见（图1）。将凝胶的染色部分转移至脱色液（20% (w/v) 甲醇）中数分钟，洗去多余的甲苯胺蓝，然后将凝胶与未染色的凝胶重新对齐。
如果需要观察更高磷酸化的肌醇异构体（IP8 和 IP9），请在室温下用甲苯胺蓝染色液染色 20 分钟。随后用脱色液洗涤约 15 分钟，去除甲苯胺蓝染料。
- 使用剃刀刀片，参照染色凝胶上确定的 IP7 迁移位置（图1），在未染色的凝胶部分切下 IP7 条带。
- 将从凝胶上切下的 IP7 条带放入一个 15 mL 离心管中，并加入 10 mL MilliQ ddH2O。将离心管置于旋转仪上，室温旋转 10 分钟。弃去液体以去除多余的 TBE 和微小的丙烯酰胺颗粒。
- 随后进行两次脱水-再水化循环。向含有 IP7 凝胶的离心管中加入 5 mL 50% (w/v) 甲醇，室温旋转 2 小时。将凝胶块转移至另一个含有 5 mL MilliQ ddH2O 的新 15 mL 离心管中，室温旋转 2 小时。不要丢弃甲醇和 MilliQ H2O。通过将聚丙烯酰胺凝胶重新转移回先前使用的 15 mL 离心管中，再重复一次脱水-再水化循环。其中一次洗涤可过夜进行。
- 为浓缩洗脱的 IP7，使用 60°C 加热的 SpeedVac 将 10 mL 溶液（5 mL MilliQ ddH2O 和 5 mL 50% (w/v) 甲醇）一起干燥。
- 当样品接近干燥时，将剩余液体（300–600 μL）转移至一个 1.5 mL 离心管中，以 5000 rpm 离心 2 分钟。
- 收集上清液并转移至新的 1.5 mL 离心管中；保留底部 20–30 μL 液体，因其可能含有丙烯酰胺颗粒。
- 如有必要，可使用未加热的 SpeedVac 继续干燥。若样品完全干燥，IP7 的回收率将显著降低，因此当样品体积达到 100–300 μL 时应终止干燥过程。
4. 确定IP7的浓度和纯度。
- 取 2–5 μL 回收的 IP7 样品，按照第 2.2–2.5 节的方法在 PAGE 胶上电泳。同时加载多个浓度梯度的 IP6（例如 0.5、1、2、4 nmol）作为浓度标准品，以及 4 nmol 的 Poly-P 标记物。电泳完成后，使用甲苯胺蓝溶液对整块凝胶进行染色和脱色，以显色肌醇焦磷酸异构体，具体操作步骤见第 3.2 节（图 2A）。
- 经甲苯胺蓝染色后，可通过扫描凝胶并使用 Image-J 等成像软件比较 IP6 与 IP7 条带的强度差异，从而确定其浓度，如 图 2B 所示。
5. 代表性结果：
IP的制备性酶促转化6 进行免疫沉淀7 使用 IP6K1 和 VIP1 酶可通过 PAGE 分析轻松分辨图1）。IP 的上样6 作为大小对照，与甲苯胺蓝凝胶染色结合，可鉴定焦磷酸化衍生物，因为其在凝胶中的迁移速率较慢，且迁移速度取决于肌醇环上磷酸基团的数量。上述步骤可实现IP的简便纯化7通过PAGE对纯化的肌醇焦磷酸进行分析，结果显示了其IP的纯度7 (图2A）。有趣的是，1/3PP-IP5 IP的异构体7 VIP1 产物的迁移速度略慢于 5PP-IP5 IP的异构体7 由IP生成的6K1. IP 的使用6 标准品可实现对纯化免疫沉淀物浓度的简便定量7 (图2B）。在使用 IP 之前7 为进一步实验，可评估其生物活性
(图35PP-IP5 与 VIP1 及免疫沉淀（IP）孵育7 磷酸酶 DDP1（二磷酸肌醇多磷酸磷酸水解酶）。通常，纯化的 IP7 转化为IP8 由 VIP1 免疫沉淀并进行 IP6 由DDP1（图3).
图1：PAGE凝胶的甲苯胺蓝染色及IP7条带的分离。 含标准品（IP6）的凝胶部分被切下，并用甲苯胺蓝溶液染色。三条条带从上至下分别为IP7、IP6和ATP。将染色后的凝胶部分与剩余凝胶对齐，从而定位含有IP7的凝胶区域，随后可将其切下并进行纯化（虚线框所示）。
图2：IP6K1 和 VIP1 反应产物的 PAGE 分析。A) 通过亚甲蓝染色分析 IP6（4、2、1、0.5 nmol），用于确定从 IP6K1（5PP-IP5）和 VIP1（1/3PP-IP5）反应中纯化的 IP7 浓度。B) 散点图分析以确定纯化后的 IP7 浓度。浓度根据条带强度（使用 ImageJ 软件计算）与已知量的 IP6 比较得出。X 轴表示强度，Y 轴表示以 nmol 为单位的浓度。
图 3：IP7 生物活性分析。 为评估纯化所得 IP7 的质量，我们将 5PP-IP5（由 IP6K1 生成的 IP7）分别与 VIP1 或 IP7 磷酸酶 DDP1 共同孵育，随后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离反应产物。DAPI 和甲苯胺蓝染色结果显示，VIP1 能够催化生成预期的 IP8，而 DDP1 可将 IP7 转化为 IP6。
讨论
由于缺乏商业化供应的化合物以及现有检测方法灵敏度较低，肌醇焦磷酸在生物化学中的应用受到严重限制。结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与甲苯胺蓝（图1）可实现对肌醇焦磷酸异构体的简便检测，其中PAGE能够分离具有不同数量磷酸基团的分子，而甲苯胺蓝是一种可与磷酸基团结合的异色性染料，该方法为相关研究开辟了新的途径20。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术纯化由IP6K1或VIP1催化的酶促反应生成的肌醇焦磷酸产物，是一种简单、经济且可靠的方案，可实现大量高纯度IP7的制备。上述方法不仅限于IP7的纯化，通过对接所述方案进行微小调整，亦可用于纯化其他种类的肌醇焦磷酸。使用IP7或不同量的IP6作为底物，可检测到含有超过八个磷酸基团的高磷酸化肌醇焦磷酸异构体20,6。这些肌醇焦磷酸可通过延长染色步骤的时间加以检测，并随后进行纯化（见3.2节）。此外，若以IP5作为酶促反应的底物，则可实现PP-IP5及其他在肌醇环上含有羟基的肌醇焦磷酸的纯化。
总之，这种简便的方法利用广泛可得的仪器即可实现对毫克级肌醇焦磷酸盐的可靠纯化，从而为这一令人兴奋的研究领域开辟了新的途径。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 A. Riccio 对本文提出的宝贵意见以及对稿件的审阅。本工作得到了医学研究理事会（MRC）对细胞生物学单元的资助，以及人类前沿科学计划基金（RGP0048/2009-C）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 植酸（IP6） | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| 多聚磷酸盐（六偏磷酸钠） | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ 盐 | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| 橙黄G | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| 磷酸肌酸（PCr） | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| 肌酸磷酸激酶（CPK） | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | 实验室自备 | 实验室自备 | |
| 丙烯酰胺:双丙烯酰胺 19:1（40%） | Flowgen | H16972 | |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/硼酸/EDTA（TBE） | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| TEMED | VWR | 43083G | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| 真空浓缩仪（SpeedVac） | Christ | 100218 | |
| 凝胶电泳装置 | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| 真空抽滤装置 | Christ | Alpha 2-4 | |
| 真空泵 | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
参考文献
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