Summary
Bicelles er lipid / amphiphile blandinger som opprettholder membran proteiner (MPS) innenfor en lipid bilayer men har unike faseoppførsel som muliggjør high-throughput screening ved krystallisering roboter. Denne teknikken har lykkes produsert en rekke høy oppløsning strukturer fra både prokaryote og eukaryote kilder. Denne videoen beskriver protokoller for å generere lipidic bicelle blandingen, som omfatter parlamentsmedlemmer i bicelle blandingen, sette opp crystallizations studier (manuelt så vel som robotically) og høsting krystaller fra medium.
Abstract
Membran proteiner (MPS) spiller en avgjørende rolle i mange fysiologiske prosesser som pumping spesifikke molekyler over den ellers tette membranen bilayer som omgir alle celler og organeller. Endringer i funksjon av parlamentsmedlemmene resultere i mange menneskers sykdommer og lidelser, derfor forblir en intrikat forståelse av deres strukturer en kritisk mål for biologisk forskning. Imidlertid fortsatt struktur fastsettelse av parlamentsmedlemmer en betydelig utfordring ofte stammer fra hydrofobisitet deres.
Parlamentarikere har betydelige hydrofobe regioner integrert i bilayer. Vaskemidler er ofte brukt for å solubilize disse proteinene fra bilayer generere et protein-vaskemiddel miceller som så kan manipuleres på en lignende måte som løselige proteiner. Tradisjonelt, krystallisering forsøk fortsette å bruke en protein-vaskemiddel blanding, men de ofte motstå krystallisering eller produserer krystaller av dårlig kvalitet. Disse problemene oppstår på grunn avvaskemiddel manglende evne til adekvat etterligne bilayer resulterer i dårlig stabilitet og heterogenitet. I tillegg vaskemiddel skjold den hydrofobe overflaten av MP redusere areal tilgjengelig for krystall kontakter. For å omgå disse ulempene parlamentsmedlemmer kan krystallisert i lipidic media, som nærmere simulerer sine endogene miljø, og har nylig blitt en de novo teknikk for MP krystallisering.
Lipidic kubikk fase (LCP) er en tredimensjonal lipid bilayer penetrert av en sammenvevd system av vandig kanalene 1. Selv monoolein er lipid av valget, har relatert lipider som monopalmitolein og monovaccenin også blitt brukt til å lage LCP 2. Parlamentsmedlemmer er innlemmet i LCP der de diffuse i tre dimensjoner og fôr krystall kjerner. En stor fordel av LCP er at proteinet forblir i et mer naturlig miljø, men metoden har en rekke tekniske ulemper inkludert høy viscosity (krever spesialiserte apparater) og vanskeligheter i krystall visualisering og manipulasjon 3,4. På grunn av disse tekniske problemer, benyttet vi en annen lipidic medium for krystallisering-bicelles 5,6 (Figur 1). Bicelles er lipid / amphiphile blandinger dannes ved å blande en phosphatidylcholine lipid (DMPC) med en amphiphile (CHAPSO) eller en kortkjedede lipid (DHPC). Innenfor hver bicelle platen, lipid molekyler generere en bilayer mens amphiphile molekylene linjen apolar kantene gir gunstige egenskaper av både bilayers og vaskemidler. Viktigere, under deres overgang temperatur, protein-bicelle blandinger har redusert viskositet og er manipulert på en lignende måte som vaskemiddel-solubilisert politikere, noe som gjør bicelles kompatibel med krystallisering roboter.
Bicelles har blitt brukt til å krystallisere flere membran proteiner 5,7-11 (Tabell 1). Denne voksende samlingav proteiner viser allsidigheten til bicelles for krystalliserende både alfa spiralformede og beta sheet parlamentsmedlemmer fra prokaryote og eukaryote kilder. På grunn av disse suksessene, og enkelhet i high-throughput implementering, bør bicelles være en del av hver membran protein crystallographer arsenal. I denne videoen, beskriver vi bicelle metodikk og gir en steg-for-steg-protokoll for å sette opp high-throughput krystallisering studier av renset parlamentsmedlemmer med standard robotikk.
Protocol
Bicelle basert krystallisering består av fire grunnleggende trinn (Figur 2): i) utarbeidelse av en bicelle forming lipid: amphiphile blanding; ii) inkorporering av renset protein i bicelle medium; iii) krystallisering studier (manuelt eller robotically), og iv) visualisering, krystall utvinning og frysing. Disse trinnene er beskrevet i detalj nedenfor
1. Utarbeidelse av Bicelles
Bicelles kan dannes i en rekke lipid: amphiphile kombinasjoner og over et bredt spekter av konsentrasjoner. Derfor er forhold-en første komposisjon basert på tidligere vellykkede anbefalt (tabell 1). De mest vellykkede blandingen er DMPC: CHAPSO bicelle formulering, som enten kan kjøpes kommersielt som en ferdigblandet klar til bruk formulering (se tabell av reagenser nedenfor) eller tilberedt på laben som beskrevet. For denne øvelsen skal vi forberede 1 ml av 35% DMPC: CHAPSO blanding på en 2.8:1 molar ratio.
- Den bicelle prosentandelen kan variere mellom 10% -40% med en DMPC: CHAPSO molar ratio fra 2.6-3.0:1 (Tabell 1).
- Merk: Jo høyere bicelle konsentrasjonen desto vanskeligere er det å oppløse lipid resulterer i en høyere oppløsning viskositet. Imidlertid kan en konsentrert bicelle formulering være en fordel når protein konsentrasjonen er lav.
- Oppløsning av lipid å få en homogen løsning krever betydelig innsats, noe som gjør dette trinnet den mest tidkrevende i bicelle metoden. Bla gjennom følgende trinn før DMPC er helt blandet:
- Varm blandingen til ~ 40 ° C ved hjelp av et vannbad eller en inkubator og vortex for ~ 1 minutt.
- Merk: Som flere sykluser er gjennomført, vil oppvarmingen blandingen resultere i en gel-lignende consistency gjør det vanskelig å virvle.
- Avkjøl blandingen på is og vortex i noen minutter. Cooling hjelper flytende løsningen gjør det enklere å virvle.
- Merk: Som flere sykluser er utført, kan blandingen bli grumsete på kjøling.
- Gjenta trinnene ovenfor (1.2.1 og 1.2.2) inntil lipid er helt oppløst.
- Merk: Denne prosessen kan ta flere timer. Bicelle formasjonen er indikert av endringene i faseoppførsel av DMPC: CHAPSO formulering. Ved ferdigstillelse vil blandingen være en klar gel på eller over romtemperatur og en tyktflytende væske på is.
- Varm blandingen til ~ 40 ° C ved hjelp av et vannbad eller en inkubator og vortex for ~ 1 minutt.
- Den bicelle blandingen er nå klar til bruk og kan oppbevares ved -20 ° C for langsiktig lagring (opptil 5 år). På grunn av faren for hydrolyse av phospholipid hodet gruppe, er det ikke tilrådelig å lagre bicelles ved romtemperatur i lengre perioder.
2. Innlemmelse av protein i bicelles
Mest MP strukturer hentet fra bicelles ble krystallisert i DMPC: CHAPSO bicelle konsentrasjon fra 2 til 8% ved hjelp av en protein konsentrasjon på 8 til 12 mg / ml (tabell 1). Hvis mulig, bør førstegangs skjermer bruke disse retningslinjene og ekstra konsentrasjoner kan bli vist på optimalisering scenen. Sammenlignet med LCP metoden, protein innlemmelse med bicelles en enkel prosess (figur 3), noe som bør gjøres samme dag som krystallisering prøvelser.
- Tine DMPC: CHAPSO bicelle blanding ved romtemperatur inntil fasen endres til en klar gel.
- Merk: Flere fryse-tiner vil ikke påvirke bicelle atferd.
- Legg blandingen på isen for å liquify og kort vortex å reetablere en homogen bicelle fase. Når plassert på is blandingen kan bli grumsete.
- From dette punktet på, holde bicelle blandingen og renset protein på is. Dette vil holde bicelle i en væskefase som gjør det mottakelig for pipettering.
- Legg til bicelle blandingen til den rensede vaskemiddel-solubilisert protein i en 1:04 (V / V) ratio.
- For eksempel: 100 mL protein-bicelle blanding oppnås ved å blande 80 mL protein med 20 mL bicelle. Hvis proteinet konsentrasjonen er 15 mg / ml og bicelle konsentrasjonen er 35%, vil dette gi en bicelle-innlemmet protein blandingen med en protein konsentrasjon på 12 mg / ml og en bicelle konsentrasjon av 7%.
- Bland ved å forsiktig pipettering innholdet opp og ned til løsningen blir klar og homogene.
- Merk: Hvis det bobler vises, kan en rask spinn (30-60 sekunder, 13 000 rpm, 4 ° C) med en tabletop sentrifuge bidra til å fjerne dem.
- Inkuber blandingen på is i minst 30 min å fremme fullstendig inkorporering av protein into bicelles. The protein-bicelle blandingen er nå klar for krystallisering prøvelser.
3. Sette opp krystallisering studier
Andre lipid krystallisering teknikker som LCP krever spesialisert utstyr på grunn av mediets høye viskositet, men den unike faseoppførsel av bicelles tillater implementering i nesten alle standard krystallisering format, inkludert robotikk (figur 3). Krystallisering forsøkene kan utføres enten hengende eller sittende slipp formater ved hjelp av standard kommersielt tilgjengelige skjermbilder.
- Enten sette opp skuffer manuelt eller ved hjelp av en krystallisering robot, opprettholde protein-bicelle blandingen på is. Dette vil holde protein-bicelle blandingen kaldt og sikre at viskositeten av løsningen er minimal.
- Manuell Krystallisering Trials - Ved hjelp av en standard pipette, kan protein-bicelle blandingen blandes med reservoar løsning på samme måte som normalt utførered for løselig eller vaskemiddel-solubilisert membran proteiner.
- Merk: Hold protein-bicelle blandingen på isen under forsøkene.
- Robotic Krystallisering Trials - Vi har skreddersydd disse studiene for Mosquito krystallisering roboten, men i prinsippet (etter samme forholdsregler) teknikken skal være kompatible med alle krystallisering roboter. Følgende tips vil sikre at protein-bicelle blandingen forblir kjølig og nøyaktig pipetteres av robot:
- Precool platen holder protein-bicelle blandingen ved å plassere den på is.
- Pipetter protein-bicelle blandingen inn i plate og fortsette å holde platen på is. Denne platen bør være den siste elementet for å gå på robot før du starter kjøringen.
- Set-up reservoaret skuffen og krystallisering lokk på plattformen 3 og 5 henholdsvis myggen roboten.
- Sett platen inneholder protein-bicelle blandingen på plattform 4av mygg roboten. Dette sikrer at protein-bicelle blandingen er den siste til å bli plukket opp av roboten og det er umiddelbart løslatt.
- For å hindre oppvarming og økt viskositet, ikke blande reservoar med protein-bicelle blanding.
- Når du utfører flere skjermer, umiddelbart returnere bicelle-protein plate til is for kjøling så snart et løp er fullført.
- Drop volum og ratio (protein: reservoar) kan velges som for konvensjonelle krystallisering prøvelser. For eksempel kan første krystall studier med Mosquito roboten settes opp med 0,25 mL protein: bicelle blanding pluss 0,25 mL reservoaret.
- Inkuber krystall studier i et kammer ved 20 ° C. Temperatur er en god screening og optimalisering parameter fordi faseoppførsel av bicelles er temperaturavhengig.
- Høyere temperaturer indusere lamellær fase 12 (figur 1), som har fordelen av pre-organiseringproteinet i lag. Temperaturer under 20 ° C kan være skjermet, men du bør ikke gå under 4 ° C da dette kan føre til at lipider å fremskynde over lengre perioder.
- På samme måte som tradisjonelle krystallisering forsøk, bør bicelle forsøk overvåkes jevnlig for krystall utseende og vekst. Vi anbefaler å kontrollere skuffer på 1. og 3. dag post-oppsett etterfulgt av ukentlige inspeksjon.
- Crystal optimalisering kan utføres med metoder som rutinemessig brukes for vaskemiddel basert krystaller inkludert nettleie screening, additive screening, skiftende temperaturer etc. I tillegg bicelle prosent og protein: bicelle ratio kan varieres. Videre kan bicelles være dopet med spesielle lipider som kan være nødvendig for protein stabilitet eller funksjon.
Fire. Visualisering, krystall utvinning og frysing
Siden krystall forsøk med protein-bicelle blanding har en viskositet tilsvarende protein-vaskemiddel dråper, visualisering og krystall utvinning er rutine og er utført som tradisjonelle oppsett.
- Visualisering: I motsetning til LCP media som ofte krever høy kvalitet belysning under normale og polarisert lys for krystall deteksjon, er visualisering ikke hindret av bicelles. Farget samt fargeløse protein krystall dråper kan enkelt analyseres ved hjelp av standard mikroskoper og ingen spesielle utstyr er nødvendig.
- Bicelles, som andre lipidic media, har en tendens til å produsere en høy andel av falske positiver. Et UV mikroskop bidrar sterkt i å skille protein fra saltkrystaller (figur 4).
- Utvinning og frysing: Crystal utvinning og frysing er relativt enkel og krever ikke oppløsning av det omkringliggende bicelle media. I tillegg gir den bicelle fasen selv noen moderate Cryo-beskyttelse.
5. Representant Resultater:
nt "> Det tar vanligvis 2-3 dager for krystaller til å vises, og ca en uke eller mer for dem å vokse til sin maksimale størrelse. Dette var tilfellet for bacteriorhodopsin og mus spennings-avhengig anion kanal 1 (mVDAC1) krystaller 4,8 . For andre membran proteiner kan det ta flere uker for krystall vekst, så det er viktig å fortsette overvåkingen av krystall forsøkene godt utover de første ukene.Som med andre lipidic media, bicelles tendens til å danne figurer som kan synes å være krystallinske. Det har også blitt observert at de fører til en høyere prosentandel av salt og vaskemiddel krystaller. Et UV-mikroskop som registrerer tryptofan fluorescens i betydelig grad kan bidra til å eliminere slike ikke-proteinavleiring falske positiver. Figur 4 viser lipid former, salt og protein krystaller som sett i synlig og UV lys til å skille de ulike resultater som kan observeres.
83fig1.jpg "/>
Figur 1. Bicelle Skjematisk. Bicelles er sammensatt av en bilayer danner lipid molekyl som DMPC (blå) og en amphiphile som CHAPSO (grønn), som beskytter de hydrofobe kantene av bilayer. Ettersom temperaturen økes, plate-lignende bicelles gjennomgå en fase transformasjon til en perforert lamellær ark 12.
Figur 2. Flytskjema for bicelle krystallisering metoden beskriver de fire grunnleggende trinn.
Figur 3. Crystal studier satt opp skjematisk. Renset vaskemiddel-solubilisert membran proteiner kan være direkte blandes med bicelles på is ved å pipettere innholdet sammen. Etter incubating protein / bicelle blandingen på is for ~ 30 minutter, krystallisering studierkan settes opp ved hjelp av en standard format, inkludert robotikk.
Figur 4. Visualisering av krystall studier. Synlig bilde (topp-panelet) og UV-image (nederst panel) av (A) Needle-formede krystaller observert i en salt-bare tilstand. Ingen fluorescens kan oppdages fra krystaller, en indikasjon på falske positive. (B) Rod-formet krystall formet i en MPD tilstand. Krystallen fluoresced svakt, men ble funnet å være ikke-proteinavleiring bruke røntgendiffraksjon. (C) Crystal observert om lag fire uker etter å sette opp forsøk. Den sterke fluorescens under UV lys bekrefter at det er et protein krystall.
| Nei. | Protein | Source | Bicelle Formulering | Protein Concentratipå | Vaskemiddel 1 | Oppløsning (a) | Referanse |
| 1 | Bacteriorhodopsin 2 | Halobacterium salinarum | 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 8 mg / ml | 2.0 | Faham og Bowie, 2002 | |
| 8% DTPC: CHAPSO (3:1) | 8 mg / ml | 1.8 | Faham et al., 2005 | ||||
| 2 | β2-adrenerge reseptor / Fab komplekse | Homo sapiens | 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) | 10 mg / ml | DDM | 3.4/3.7 | Rasmussen et al. 2007 |
| 3 | Spenning-avhengige anion kanal 1 | Mus musculus | 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 12 mg / ml | LDAO | 2.3 | Ujwal et al. 2008 |
| 4 | Xanthorhodopsin | Salinibacter ruber | 4,2% DMPC, 5% NM | 4 mg / ml | DDM | 1.9 | Luecke et al. 2009 |
| 5 | Rhomboid protease | Escherichia coli | 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) | 9 mg / ml | Nonyl glucoside | 1.7 | Vinothkumar, 2011 |
1 Vaskemiddel brukt til membran protein rensing
2 Native lipider fra lilla membranene kan utføres sammen under rensing
Tabell 1. Sammendrag av krystallvann vilkår for membran protein strukturer løses ved hjelp bicelles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bicelles er en unik lipidic media som tilbyr en innfødt bilayer-lignende miljø mens oppfører seg som om solubilisert av vaskemidler. Denne egenskapen gir bicelles en klar fordel over andre lipid-baserte krystallisering metoder ettersom det ikke er noen læringskurve eller spesialisert utstyr som kreves for denne teknikken. Når bicelles er tilgjengelige, enten kommersielle eller tilberedes i laboratoriet, kan de være direkte blandet med renset protein, og fra dette punktet på krystallisering forsøk fortsette nesten akkurat som med vanlig vaskemiddel basert protokoller. Videre bicelles tilby flere praktiske fordeler sammenlignet med andre teknikker, inkludert utvidet lagring perioder, enkel innlemmelse av protein, high-throughput kapasitet ved hjelp av standard robotikk og rutine visualisering og krystall utvinning. En annen klar fordel er muligheten til å dope bicelles med spesifikke lipider for optimalisering eller hvis vist gunstig for protein av interesse. Til sammen lipinordiske bicelle metoden gir betydelig allsidighet i kombinasjon med praktisk ease-of-bruk, noe som gjør det lett adoptable for alle membran protein krystallisering prosjekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Drs. James Bowie og Salem Faham for å gi teknisk ekspertise og veiledning om bicelle metoden og Dr. Aviv Paz for nyttige diskusjoner. Vi erkjenner Le Du for eksperimentell støtte. Rachna Ujwal har økonomisk interesse i MemX biovitenskap LLC, som imidlertid ikke støtte dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
