Summary
कृंतक रीढ़ की हड्डी में संवेदी afferents के स्टिरियोटाइप अनुमानों एक आसानी से सुलभ प्रयोगात्मक प्रणाली एकल axons की अनुरेखण के माध्यम से axonal शाखाओं में अध्ययन की पेशकश करते हैं.
Protocol
1. विच्छेदन प्रक्रिया
नोट: चूहों के प्रायोगिक उपयोग आधिकारिक तौर पर और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए अनुमोदित होना चाहिए.
- तैयारी पहले, अपने विदारक माइक्रोस्कोप सेट और शल्य विच्छेदन के लिए बड़े और छोटे कैंची, बड़े दांतेदार संदंश, घुमावदार संदंश और Dumont No.5 के चार सेट विदारक संदंश (जिनमें से दो अंदर पॉलिश सुझाव है) सहित आवश्यक उपकरणों देना ( विवरण के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका देखें). फिल्टर पेपर के एक पत्रक एक 100 मिमी Sylgard लेपित पेट्री डिश में रखें. 12 अच्छी तरह से एक थाली, एक 100 मिमी पेट्री डिश और एक 12 मिलीलीटर ट्यूब के कुओं में ठंड पीबीएस डालो और बर्फ पर छोड़ दें. पिपेट एक दूसरे 12 अच्छी तरह से और बर्फ पर थाली जगह के प्रत्येक कुएं में नियतन बफर 2ml (पीबीएस, 7.4 पीएच में 4% paraformaldehyde).
- Anesthetization के बाद, E12.5 (योनि प्लग का पता लगाने के E0.5 के रूप में नामित किया गया था) पर समय गर्भवती बांध बलिदान, माउस जगहकागज तौलिये के तीन चादरें और 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र सोख पर अपने ventral पक्ष अप के साथ.
- उदरगणिका गुहा खोलें, द्विपक्षीय गर्भाशय सींग अलग करने और उन्हें ठंडा पीबीएस के साथ 100 मिमी व्यंजनों की एक में हस्तांतरण.
- सूक्ष्म नियंत्रण के तहत, छोटे, सीधे कैंची के साथ गर्भाशय की दीवार का एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए और दूर नाल से प्रत्येक amniotic थैली में कटौती.
- पील दूर प्रत्येक भ्रूण और गर्भनाल से एमनियोटिक थैली में कटौती.
- छोटे कैंची का प्रयोग, भ्रूण सिर काटना और सिर या उनमें से एक हिस्सा अलग जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए अगर जीनोटाइपिंग आवश्यक होना चाहिए डाल दिया. इसके बाद ठंड पीबीएस के साथ 12 अच्छी तरह से थाली के संबंधित कुओं torsi हस्तांतरण.
- पीबीएस की कुछ बूंदों के साथ Sylgard डिश में फिल्टर पेपर गीले और अपनी पृष्ठीय पक्ष के साथ एक भ्रूण धड़ कागज पर स्थिति. बेहतर स्थिरता के लिए, शरीर से दूर अपनी पूंछ और extremities सीधा.
- कार्यलगभग 16x बढ़ाई के साथ एक विदारक खुर्दबीन के नीचे, ध्यान से ठीक इत्तला दे दी संदंश के दो जोड़े के साथ रीढ़ की हड्डी के ऊपर भ्रूण की त्वचा चुटकी और धीरे इसे फाड़. शुरुआत बीच में, पहले पूंछ की ओर आगे बढ़ना है और फिर बीच पूर्वकाल पक्ष की ओर से शुरू करने.
- पीबीएस के दो या तीन बूँदें इसे सूखने से रोकने के साथ समय - समय पर भ्रूण गीले.
- कि DRG को रोकने के लिए रीढ़ की हड्डी से teared कर रहे हैं जब यह भ्रूण से निकाल दिया जाता है DRG और अंदर पॉलिश सुझावों के साथ एक ठीक संदंश के ब्लेड के साथ क्षैतिज फिसलने आंदोलनों से रीढ़ की हड्डी के आसपास कार्टिलेजीनस कशेरुका स्तंभ से अलग है. भ्रूण के दाईं ओर के मध्य में शुरू, पूंछ की ओर अपना रास्ता काम करते हैं और फिर पूर्वकाल अंत करने के लिए. बाद में, दूसरी तरफ प्रक्रिया दोहराएँ. चीर नहीं जुड़े DRG सावधान रहें.
- पूरी तरह से भ्रूण से ढीला रीढ़ की हड्डी को अलग करने के लिए, अपने cervic लेनेठीक संदंश के साथ अल हिस्सा है और यह अपनी दुम का अंत की ओर एक टुकड़ा में बाहर खींच.
- डूब पृथक संलग्न DRG के साथ 12 निर्धारण बफर के साथ अच्छी तरह से भरा थाली के एक कुएं में रीढ़ की हड्डी और शेष भ्रूण से रीढ़ की हड्डी डोरियों की तैयारी के साथ आगे बढ़ना.
- रीढ़ की हड्डी डोरियों बर्फ पर कम से कम दो घंटे तय.
2. DRG न्यूरॉन्स के DiI लेबलिंग
- प्रत्येक लेबल किया जा करने के लिए रीढ़ की हड्डी की हड्डी के लिए, एक micropipette खींचने के साथ दो गिलास सुई तैयार. : हम Sutter मॉडल P-97 इलेक्ट्रोड (खींचने प्रोग्राम की स्थापना का उपयोग करें.., 2 हिट = 600, VEL = 25, समय = 175, 3 हिट = 630, VEL = 1 हिट = 625, VEL = 35, समय = 175 30, समय = 150).
- इथेनॉल में 5% (w / v) DiI के समाधान में सूक्ष्म नियंत्रण के तहत प्रत्येक गिलास सुई की नोक तीन से पांच बार डुबकी. इथेनॉल के वाष्पीकरण सुई पर एक DiI क्रिस्टल की एक पतली परत बनाता है.
- लगभग 40x के साथ एक magnification एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कार्य, अपने वी के साथ एक रीढ़ की हड्डी की जगहentral किसी स्लाइड पर ऊपर की ओर. वसंत कैंची का प्रयोग, ventral पक्ष पर अपनी पूरी लंबाई में floorplate के माध्यम से काटने के बाद एक औंधा खुली किताब मोड में तैयारी के बढ़ते (देखें अनुभाग सी) की अनुमति से गर्भनाल खोलने.
- किसी स्लाइड पर पृष्ठीय पक्ष के साथ रीढ़ की हड्डी की स्थिति. तो मैन्युअल रूप से सूक्ष्म दृश्य के तहत DiI कवर गिलास सुई की नोक और ध्यान पियर्स रीढ़ की हड्डी की एक तरफ हर दूसरे DRG के साथ गर्भनाल दृष्टिकोण. DiI की लगभग कोई निशान छेदा DRG में दिखाई केवल न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या की लेबलिंग यह सुनिश्चित करना चाहिए. कॉर्ड के दूसरे पक्ष के लिए एक दूसरे सुई ले लो. केवल हर दूसरे DRG एमिंग पड़ोसी DRG है जो व्यक्ति axons की भेदभाव को मुश्किल हो सकती है से लेबल axonal अनुमानों के एक ओवरलैप से बचा जाता है.
- रीढ़ की हड्डी निर्धारण और अंधेरे में बफर सेते परिवेश के तापमान पर कम से कम छह घंटे या 4 में रात भर के लिए वापसी ° सी डाई के लिए समय di देने के लिएप्लाज्मा झिल्ली के भीतर अक्षतंतु साथ ffuse. एक लंबी ऊष्मायन अवधि (4 में दो दिनों ° सी) के लिए अनुमति दें अगर रीढ़ की हड्डी में संपार्श्विक विकास के विश्लेषण के वांछित है.
3. बढ़ते और सूक्ष्म विश्लेषण
- डाई प्रसार की स्थिति, अपनी पृष्ठीय पक्ष के साथ एक एकल रीढ़ की हड्डी के बाद नीचे पीबीएस की एक बूंद में एक coverslip पर. ध्यान रखना कि संलग्न DRG सही ढंग से कर रहे हैं उन्मुख laterally और मिलाना नहीं है. अतिरिक्त तरल पदार्थ महाप्राण (व्यंजन) और एक औंधा खुली किताब संदंश का उपयोग मोड में कॉर्ड समतल.
- पीबीएस का उपयोग कर एक खुर्दबीन स्लाइड पर तैयारी माउंट.
- अवांछित लेबल axonal अनुमानों की पृष्ठभूमि धुंधला प्रतिदीप्ति सूक्ष्म विश्लेषण की वृद्धि को रोकने के लिए किया जाना चाहिए बढ़ते दिन. तब तक अंधेरे में 4 में स्लाइड्स रखने डिग्री सेल्सियस
4. प्रतिनिधि परिणाम:
माउस की रीढ़ की हड्डी अभिवाही जनसंपर्क प्राप्तगर्भाशय ग्रीवा के 8 जोड़े से ojections, वक्ष के 13 जोड़े, त्रिक DRG की काठ और 4 जोड़े के लिए कुल 60 रीढ़ की ganglia के 5 जोड़े. कुछ प्रशिक्षण के बाद सबसे DRG अभी भी संलग्न के साथ एक रीढ़ की हड्डी में पांच मिनट के अंतर्गत में एक भ्रूण से अलग किया जा सकता है है. यह प्रक्रिया E11.5 से E13.5 माउस भ्रूण से जुड़ी DRG के साथ रीढ़ की हड्डी डोरियों के अलगाव के लिए अनुकूल है. हालांकि, सबसे अच्छा परिणाम E12.5 से प्राप्त कर रहे हैं. लेबलिंग यहाँ वर्णित प्रक्रिया के अनुकरणीय परिणामों 3 चित्र में दिखाया जाता है. रीढ़ की हड्डी की पूरी लंबाई पर DRG की लेबलिंग तो अलग कशेरुका (4 छवि) के स्तर पर axonal शाखाओं में बंटी व्यवहार यों इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1 योजना axonal शाखाओं में बंटी के दो प्रमुख मोड चित्रण. के रूप में यहाँ संकेत - (ए) विकास कोन है कि एक विभाजन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की गतिविधियों से शाखाओं में बंटी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जटिल टर्मिनल arbors या(बी) अक्षतंतु शाफ्ट पर संपार्श्विक गठन (बीचवाला शाखाओं में बंटी). उत्तरार्द्ध मोड हावी cortical और thalamocortical axons 6,7 पेश की शाखाओं में बंटी प्रकार है.
चित्रा 2 भ्रूण रीढ़ की हड्डी में DRG न्यूरॉन्स के अभिवाही अनुमानों axonal शाखाओं में बंटी के दोनों प्रकार प्रदर्शित: द्विभाजन द्वारा DREZ (1) और परिणामस्वरूप बीचवाला शाखाओं में बंटी (2) द्वारा एक प्रतीक्षा अवधि के बाद बेटी शाखाओं कोलेटरल्स फार्म से axons पहली शाखा.
चित्रा 3 भ्रूण माउस DRG न्यूरॉन्स की एकल axonal trajectories के विज़ुअलाइज़ेशन. (ए) संलग्न DRG के साथ रीढ़ की हड्डी एक E12.5 माउस भ्रूण से तैयार है. (स्केल पट्टी, 1 मिमी) (बी) DiI लेबल बढ़ती बढ़ाई जंगली प्रकार चूहों के DRG पृष्ठीय दृश्य दिखाए जाते हैं. बी में हर दूसरे DRG labele हैDiI द्वारा घ. प्रतिदीप्ति छवियों औंधा कर रहे हैं, दुम का बाईं पर है और सी और डी, पार्श्व में नीचे स्थित है. सी में axons की एक छोटी संख्या लेबल है और उच्च बढ़ाई टी की तरह शाखाओं की उपस्थिति रीढ़ की हड्डी के DREZ में पहचाना जा सकता है. (स्केल सलाखों, 250 सुक्ष्ममापी (बी), 100 (सी) सुक्ष्ममापी और 50 सुक्ष्ममापी (डी).)
चित्रा 4 टी के आकार शाखाओं, जंगली प्रकार में एकल विजय - स्तम्भ या दुम का मुड़ता और सी प्रकार natriuretic पेप्टाइड (CNP) की कमी E13.5 पर चूहों की मात्रा. एकल गिना axons की संख्या कोष्ठक में प्रत्येक जीनोटाइप के लिए अलग ट्रंक स्तर के लिए दिया जाता है. लांगुलिय या विजय - स्तम्भ की दिशा में ही वृद्धि क्रमशः, सी या आर बदल जाता है.
5 चित्रा एक cGMP संकेतन मार्ग संवेदी अक्षतंतु द्विभाजन रीढ़ की हड्डी के DREZ पर चलाता है. (क) की योजनाcGMP संकेतन ligand CNP, रिसेप्टर guanylyl साइक्लेज Npr2 और सेरीन / threonine kinase cGKIα भ्रूण DRG न्यूरॉन्स में बना मार्ग है. Npr2 CNP द्वारा उत्तेजना पर GTP से cGMP उत्पन्न करता है. (बी) DiI जंगली प्रकार और CNP की कमी चूहों में न्यूरॉन्स DRG की एक axons की अनुरेखण. (स्केल पट्टी, 25 सुक्ष्ममापी)
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Discussion
टकसाली प्रक्षेपण axonal शाखा गठन के दोनों प्रकार की तैयारी के DiI लेबलिंग के लिए तय ऊतक के उपयोग के साथ संयोजन में आसानी से एक साथ शामिल पैटर्न संलग्न DRG शाखाओं में बंटी axonal अध्ययन के लिए एक अनुकूल मॉडल के साथ भ्रूण रीढ़ की हड्डी बना देता है. DRG न्यूरॉन्स के छोटे समूहों के दृश्य और जिससे व्यक्ति axons और उनकी शाखाओं में बंटी पैटर्न के विश्लेषण - DRG के थोक लेबलिंग के विपरीत DiI के मिनट मात्रा में लेपित गिलास सुई का उपयोग करने के आवेदन की अनुमति देता है. वर्णित विधि आगे lipophilic अनुरेखक जो आगे लेबल 8 न्यूरॉन्स की संख्या कम हो जाती है iontophoretic इंजेक्शन द्वारा सुधार किया जा सकता है. हालांकि, यह अधिक समय लेने वाली होगी.
भ्रूण रीढ़ की हड्डी की पूरी माउंट तैयारी में एकल axonal trajectories के DiI लेबलिंग एक cGMP संकेत झरना शामिल ligand CNP, अपने Npr2 रिसेप्टर की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, औरcGMP पर निर्भर kinase cGKIα कि axonal शाखाओं में बंटी के एक प्रकार को नियंत्रित: 4,5,9-12 DREZ में न्यूरॉन्स DRG के विभाजन . CGMP संकेत म्यूटेंट में न्यूरॉन्स DRG के जंगली प्रकार, axons के विपरीत DREZ (5 छवि) में विभाजित करने के बजाय केवल एक दिशा में, बारी . इन अध्ययनों से यह भी पता चला है कि संपार्श्विक गठन cGMP संकेत संकेत है कि शाखा DRG न्यूरॉन्स में मनाया गठन के इस दूसरे प्रकार अलग 4 विनियमित है म्यूटेंट में प्रभावित नहीं था कि.
वैकल्पिक रूप से, एकल DRG axons की शाखाओं में बंटी व्यवहार भी ट्रांसजेनिक माउस 13 न्यूरॉन्स DRG या फ्लोरोसेंट मार्करों का एक संयोजन है जो एक व्यक्ति 14 न्यूरॉन्स के बीच भेद करने के लिए अनुमति देता है जिसमें केवल एक छोटे सबसेट में या तो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त लाइनों में अध्ययन किया जा सकता है है. हालांकि, उत्परिवर्ती माउस मॉडल फ्लोरोसेंट माउस लाइनों के साथ विश्लेषण किया जा पार नस्ल के प्रयास माना जा. इसके अलावा, promotor (Thy1) ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति के कारण प्रसव के बाद यह मुश्किल पता लगाने के लिए कि क्या एक मनाया phenotype शाखाओं में बंटी बिगड़ा शाखा के गठन के भ्रूण के विकास या एक बाद की अध: पतन के दौरान परिणाम है बना चरणों में ही शुरू होता है बजाय प्रक्रिया. इसके विपरीत, भ्रूण DRG DiI लेबलिंग के समय में जब axonal शाखाओं में बंटी होता axonal शाखाओं में बंटी और उपयुक्त माउस म्यूटेंट में व्यवधान की प्रक्रिया का अध्ययन करने का फायदा है.
भ्रूण संलग्न DRG साथ रीढ़ की हड्डी डोरियों की तैयारी और अन्य लेबलिंग प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (पूरे माउंट में स्वस्थानी संकरण, LacZ या ट्रांसजेनिक चूहों की एपी धुंधला हो जाना), रीढ़ की हड्डी के संग्रह और शाही सेना के अलगाव के लिए DRG ऊतक, या जब अनुकूलित टिशू कल्चर प्रयोगों और कैल्शियम इमेजिंग या electrophysiological माप की तरह बहाव के अनुप्रयोगों के लिए बाँझ शर्तों के.
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Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उपयोगी टिप्पणी के लिए डॉ. एलिस्टेयर Garratt (अधिकतम Delbrück केंद्र, बर्लिन) धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) के सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र (SFB665) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
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