Summary
Här har vi detalj en metod för snabb isolering av mus-intestinala dendritiska celler (DC) och makrofager. Fenotypisk karakterisering av intestinala DC och makrofager utförs med hjälp av multi-color flödescytometrianalys medan magnetiska pärlor anrikning följt av cellsortering används för att ge mycket rena populationer för funktionella studier.
Abstract
Inom tarmen bor unika populationer av medfödda och adaptiva immunceller som är involverade i främjandet av tolerans mot kommensalism flora och antigener mat medan samtidigt resterande redo att montera inflammatoriska reaktioner mot invasiv patogener 1,2. Antigenpresenterande celler, i synnerhet DCS och makrofager, spela kritiska roller i att upprätthålla intestinal immunhomeostas via deras förmåga att känna av och på lämpligt sätt svara på mikrobiota 3-14. Effektiv isolering av intestinala DC och makrofager är ett kritiskt steg vid karakterisering av fenotyp och funktion hos dessa celler. Medan många effektiva metoder för att isolera intestinala immunceller, inklusive DC och makrofager, har beskrivits 6,10,15-24 många förlitar sig på långa digestioner gånger negativt kan påverka cellens uttryck ytantigen, cellviabilitet och / eller cell avkastning. Här, i detalj vi en metod för snabb isolering av ett stort antal viable, intestinala DC och makrofager. Fenotypisk karakterisering av intestinala DC och makrofager sker genom direkt färgning isolerade intestinala celler med specifika fluorescens-märkta monoklonala antikroppar för flerfärgs-flödescytometrisk analys. Dessutom är mycket ren DC och populationer makrofag isolerades för funktionella studier som använder CD11c och CD11b magnetiska cellsortering pärlor följt av cellsortering.
Protocol
1. Dissektion och Dissociation av tarmepitelceller
Beredning av reagens och utrustning:
- Varm Ca 2 + / Mg2 +-fri PBS (CMF PBS) till rumstemperatur.
- Varm Ca 2 + / Mg2 +-fri HBSS med 5% FBS (CMF HBSS / FBS) och 2 mM EDTA till rumstemperatur.
- Varm orbitalskakare till 37 ° C.
Notera: Stegen 1,1 till 1,7 måste utföras så snabbt som möjligt för att minimera omfattningen av celldöd och för att uppnå maximal cellutbyte.
- Euthanize möss i en CO 2 kammare och spraya 70% etanol på buken och bröstkorgen.
- Göra en liten horisontell snitt i mitten av buken med en sax och skala bort huden för att exponera bukhålan.
- Vidare för att separera magsäcken från den övre tunntarmen genom att skära vid musculus sphincter pylori. Retas bort tarmkäxet med pincett och skärs på nytt vidden ileo-cekal ventil för att frigöra hela tunntarmen från tjocktarmen. Gör ett snitt i analöppningen och igen retas isär tarmkäxet tills tjocktarmen är gratis.
- Skär upp i tjocktarmen longitudinellt med sax och tvätta bort avföringen innehåll och slem från tarmlumen i CMF PBS vid rumstemperatur.
- Använda sax och tång för att makroskopiskt dissekera ut de Peyerska placken längs den anti-mesenteriska yta av tunntarmen och uppskuren tunntarmen längdled.
- Tvätta de tunntarmen lumen av fekalt innehåll och slem i CMF PBS vid rumstemperatur.
- Separat klippa liten / tjocktarmen i cirka 1,5 cm bitar och lägg i separata 50 ml koniska rör innehållande 30 ml förvärmd CMF HBSS / FBS och 2 mM EDTA. Lägg inte mer än 1 tarmen per 50 ml koniskt rör.
- Horisontellt placera varje 50 ml koniskt rör på en orbitalskakare och skaka under 250 rpm under 20 min vid 37 ° C. </ Li>
- Placera en sil mesh tråd under ett slöseri hink och häll innehållet i varje 50 ml koniskt rör genom att återvinna 1,5 cm bitar av tarmen och placera dem i separata 50 ml koniska rör innehållande 30 ml förvärmd CHBSS / FBS med 2 mM EDTA.
- Upprepa 1,8.
2. Tissue Matsmältning och isolering av tarmceller
Beredningar av reagens och utrustning:
- Kollagenaslösning: 1,5 mg / ml typ VIII Kollagenas löstes i förvärmd CMF HBSS / FBS med 40 | ig / ml DNas I.
- Förvärmd CMF HBSS / FBS och 2 mM EDTA.
- Förvärmd orbitalskakare vid 37 ° C.
- Iskall CMF HBSS / FBS.
- Efter den andra omgången av skakningar, häll innehållet i varje 50 ml koniskt rör genom silen och överföra 1,5 cm bitar av tarmen för att en liten plast väger båten efter badda bort överflödigt material med en pappershandduk.
- Snabbt finhacka 1.5 Cm bitar av tarmen med sax direkt i vikt båten och lägga malet tarmen till 20 ml kollagenas lösning. Horisontellt placera varje 50 ml koniskt rör på en orbitalskakare och koka vid 200 rpm under 10-20 minuter vid 37 ° C. Se diskussionen nedan angående optimering.
- Kortfattat virvel för att säkerställa grundlig upplösning av eventuellt kvarvarande tarmvävnad och filtrera genom en 100 | im cellfilter direkt in i en 50 ml koniskt rör.
- Top off varje 50 ml koniskt rör med CMF HBSS / FBS och centrifugera vid 1500 rpm under 5 min vid 4 ° C. Om en fast pellet inte observeras för kolon prover efter centrifugering, bör proverna centrifugerades åter för 3,5 min. Upprepa detta tvättsteg gång.
- Häll av vätskan och resuspendera cellpelleten i iskall CMF HBSS / FBS och prover placera på is.
- Fortsätt till Avsnitt 3 för FACS förvärv / analys eller 4 § för magnetisk-pärlor berikande för hög hastighet cell sorting.
3. Antikroppsfärgning för Flerfärgs Flödescytometrisk analys av DC: er och makrofager
Beredningar av reagens och utrustning:
- Iskallt CMF PBS.
- Iskall buffert färgning (CMF PBS + 5% FBS).
- Framställ död cell fläck i iskall CMF PBS vid 1:1000 spädning med användning av LIVE / DEAD torrt magnetpulver, fixerbart Aqua död cell Stain Kit.
- Förbered cocktail antikroppsfärgning genom att lägga till följande fluorescens-märkta monoklonala antikroppar (mAbs) till iskall färgning buffert: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA B)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.
- Överföra cellerna till ett 5 ml polystyren med rund botten (FACS) rör.
- Tvätta cellerna två gånger i iskall CMF PBS.
- Inkubera proverna med döda celler färgas under 15 minuter på is i mörker.
- Tvätta cellerna två gånger i iskall CMF PBS.
- Blockera celler med 2.4G2 anti-FcγRIII/II i iskall färgningbuffert under 10 min på is.
- Tvätta cellerna i iskall färgningsbuffert.
- Inkubera prov med antikroppsfärgning cocktail för 20 min på is i mörker.
- Tvätta cellerna med iskall färgning buffert två gånger och återsuspendera prover i 400 pl iskall buffert färgning och passerar genom 40 ^ m filter locket på FACS-rör.
- Skaffa prov på LSR II cytometer (BD) som definieras i gating strategin i avsnitt 5 och figur 1.
4. Anrikning av DC: er och makrofager från tarmen
Beredningar av reagens och utrustning:
- Iskall buffert färgning (CMF PBS + 5% FBS).
- Inkubera enkelcellsuspension erhållen från steg 2,5 med CD11b och CD11c MACS pärlor i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Tvätta cellerna med iskall buffert färgning följt av centrifugering.
- Kassera supernatant och återsuspendera cellpelleten i 1 ml iskall buffert färgningoch passera genom en 100 | im cellfilter följt av en 40 | im cellfilter.
- Berika för magnetiska pärlor-anslutna celler med positiv selektion med MACS LS magnetiska kolumn.
- Upprepa steg 4,2 och kasta supernatanten.
- Inkubera celler med mAb ytmarkör som beskrivs i steg 3.7.
- Tvätta magnetiska pärlor-anrikade cellerna två gånger med iskall färgningsbuffert. Återsuspendera cellpelletar i 500 | il iskall färgningsbuffert utan natriumazid, och passerar genom 40 ^ m cellfilter till ett FACS-rör.
- Fortsätt till FACS-sortering på BD ARIA II Cell Sorter att sortera intestinal DC och / eller undergrupper makrofager av intresse.
5. Gating strategi för LP APC
Notera: Observera att ofärgade intestinala celler kan användas som en negativ kontroll för att bidra till en korrekt placering av portarna för att separera positiva och negativa populationer.
- Såsom visas i figur1, skapar en plot och utesluta celler som är positiva för den döda cellen fläcken (Fig. 1 A), följt av uteslutandet av dublett händelser (fig. 1B och C). Sedan, grinden på cellerna av intresse enligt framåt-och sidospridning och se till att utesluta partiklar (fig. 1D).
- Skapa en annan plot och vidare porten på CD45 + och IA b + celler, som fenotypiskt karaktäriserar APC (Fig. 1E).
- På en separat punktdiagram, analysera CD11b och CD11c uttryck för att skilja specifika DC och makrofag delmängder (R1, R2 och R3,. Figur 1F). Celler från R1 är CD11c + CD11b matta / - celler. Regionen, R2, avgränsas så att dessa celler har liknande nivåer av ytan uttryck för CD11c som i celler av R1, men cellerna i R2 också uttryckligen CD11b. Därefter R3 region som utsetts celler som är CD11b + och CD11c trist / -.
- Enalyze regioner R1, R2 och R3 ytterligare för F4/80 och CD103 uttryck för att differentiera makrofag-och DC-populationer, respektive. Den CD11c + CD11b trist / - celler R1 uttrycker höga nivåer av aE integrin, CD103, och låga nivåer av F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + celler av R2 är sammansatta av både DC-och makrofager baserat på deras dikotom expression av CD103 och F4/80 (fig. 1 H). Slutligen CD11b + CD11c matta / - celler R3 utgör makrofager baserade på fenotypisk profil F4/80 + och CD103 - (Bild 1I) 16.
6. Representativa resultat
Figur 1. Gating strategi för intestinala utvecklingsländer och makrofager. Döda celler (A) och dubbletter (B och C) först uteslutna från analys och sedan små intestinella celler var grindas enlighet därmed för att framåt-och sidospridning (D), och APC definieras som CD45 + lA b + (E). Makrofager och DCS identifierades genom uttryck av CD11b och CD11c (F). CD103 och F4/80 uttryck för celler pre-gated på R1 (G), R2 (H) och R3 (I) populationer analyserades.
Figur 2. Cell avkastning och antikroppsfärgning kvalitet beror på koktiden. CD11b och CD11c färgningsmönstret och total cellavkastningen av under-(A, D), optimalt-(B, E) eller över-digererad (C, F) intestinal vävnad.
Intestinala celler isolerades från en C57BL / 6 mus tunntarmen och DC: er och makrofager analyserades med FACS på BD LSR II. Spänning och ersättning sattes med ofärgade och enkel fluorokromkonjugerade färgade splenocyter. Döda celler (Fig. 1 A) och dubbletter (Fig. 1 B och C) var först uteslutna frånanalysen. Celler av intresse analyserades sedan enligt framåt-och sidospridning (fig. 1D) följt av grindning på CD45 + och lA b +-celler (Fig. 1E). Därefter tillsattes CD11b och CD11c uttryck bedömas av CD45 + lA b +-celler för att avgränsa tre regioner (R1, R2 och R3;. Fig. 1F). CD103 och F4/80 expression i de tre regionerna utvärderades för att skilja mellan DC och makrofager, respektive. Den CD11c + CD11b trist / - celler R1 uttryckte höga nivåer av aE integrin, CD103, och låga nivåer av F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + celler R2 bestod av både DC och makrofager baserat på deras dikotoma uttryck för CD103 och F4/80 (Fig. 1 H) medan CD11b + CD11c matta / - celler R3 utgör makrofager baserade på fenotypisk profil F4 / 80 + och CD103 - (
Förhållandet mellan längden av vävnad matsmältningen på totalt cell avkastning och uttryck av CD11b och CD11c illustreras i figur 2. Tarmvävnad som digererades under 3 min (under-digerering) gav låga totala cellantalet (fig. 2D) och sålunda få DC och makrofager som finns tillgängliga för karakterisering (Fig. 2A). Vävnad digerering för 11 minuter producerade en stark utbyte av levande celler (fig. 2E) med populationer av DC: er och makrofager som uttryckte höga nivåer av CD11b och CD11c och var fenotypiskt distinkta (fig. 2C). I motsats härtill resulterade digerering under 50 min (under-digerering) på ett liknande cellutbyte vid samtidigmpared optimerad nedbrytning (fig. 2E och F), men blev avgränsning av olika cellpopulationer med CD11b och CD11c mer obskyra som ett uttryck för CD11c minskad (Fig. 2C) och antalet döda celler ökade (data visas ej).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Figur 3. Faktorer som är viktiga för optimering av cell avkastning och ytantigen uttryck. Cell avkastning och ytantigen uttryck direkt påverkas av varaktigheten av vävnad matsmältningen de särskilda egenskaper kollagenas, graden av vävnaden mals och förekomsten eller frånvaron av inflammation, som kan påverka vävnader integritet och cellularitet. Långvarig vävnaden matsmältningen kan resultera i minskad cellviabilitet och ytantigen uttryck, medan otillräcklig vävnad matsmältningen kan resultera i en brist på celler för analys.
Här beskrivs har vi en metod för snabb isolering av mus intestinala DC och makrofager för fenotypisk karaktärisering med hjälp av multi-color flödescytometri och berikning med MACS pärlor och cellsortering att utföra funktionella studier renade celler. Optimera koncentrationen av kollagenasoch varaktigheten av vävnad matsmältning är nödvändig för att producera en stabil cellutbyte utan att kompromissa viabilitet och ytantigen uttryck. Under-digerering ger en låg totalt cellantal och en brist av DC: er och makrofager för karaktärisering (fig. 2A och D). Å andra sidan, ger över-digerering en totalt cellantal liknande optimerade betingelser (fig. 2F) men antalet döda celler är märkbart ökat (data ej visade) och kvaliteten på den färgning äventyras. I likhet med under-matsmältningen, skulle över-nedbrytning av vävnaden komplicerar fenotypisk karakterisering och rening.
Flera ytterligare parametrar för behandling som använder detta protokoll är tillverkare, typ och visst parti kollagenas, integritet och cellularitet i tarmen, och graden av vävnad malning. Som variation i kollagenasaktivitet kan finnas mellan olika tillverkare, typ av kollagenas och lo produktionts, potensen hos digerering kan variera stort och kräver optimering. Därför är valet av den lämpligaste typen av kollagenas kritisk när man utformar ett experiment eftersom kvaliteten och reproducerbarheten av data kan påverkas. Enligt vår erfarenhet har kollagenas typ VIII från Sigma-Aldrich som bästa resultat, har vi dock hade även framgång med hjälp kollagenas typ IV från Sigma-Aldrich.
Även om den ovan detaljerade protokollet har optimerats för användning på friska tunntarm och tjocktarm, kan den med fördel användas för isolering av DC: er och makrofager från inflammerad vävnad uppvisar ökad cellularitet och arkitektoniska distorsion är associerad med inflammation. Närvaron av intestinal inflammation kan dramatiskt påverka hastigheten av spjälkning, ofta att öka känsligheten av den intestinala vävnaden för verkan av proteolytiska enzymer på basis av vår erfarenhet. Därför, hur länge matsmältningen eller Koncentrationn av kollagenas måste anpassas till förändringar i vävnadsintegritet associerade med inflammation.
Vidare kommer graden av mals vävnaden påverka varaktigheten av vävnad digerering. Mals vävnaden i mindre bitar ökar ytan för matsmältningen och ger fler celler, men försiktighetsåtgärder vidtas, eftersom vävnaden kan vara mer mottagliga för över-matsmältningen. Följaktligen kan varaktigheten av matsmältningen behöva minskas. I motsats härtill kommer dålig mals resulterar i större bitar av vävnad som kommer att smälta dåligt resulterar i en låg total cellutbyte. Öka längden på matsmältningen kan kompensera för dålig malning till en viss utsträckning.
Vid optimering av parametrarna för tarmvävnad digerering med kollagenas, kan en stabil cellutbyte snabbt uppnås. Som ett resultat kan intestinal DC och populationer makrofag vara mer exakt karaktäriseras och renas för funktionella studier för att bedöma cytokinproduktion, antigen presentation, och regleringen av immunceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Aaron Rae (Emory University Institutionen för pediatrik och barn Healthcare Atlanta Flow Core) för cell sortering. Detta arbete stöddes av NIH bidrag AA01787001, en Career Development Award från Crohns och kolit Foundation of America, och en Emory-Egleston barn Research Center säd bidrag till TLD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
References
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
- Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
- Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G.
- Rescigno, M.
- Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
- Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
- Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
- Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
- Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
- Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
- Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
- Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
- Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
- Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. , 187-733 (2011).
- Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
- Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
- Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
- Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
- Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
- Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
- Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).
