Summary
Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide des cellules dendritiques de souris intestinales (DCS) et les macrophages. Caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée en utilisant plusieurs couleurs d'écoulement analyse cytométrique tandis magnétique enrichissement bourrelet suivie par tri cellulaire est utilisé pour donner des populations de grande pureté pour des études fonctionnelles.
Abstract
Dans l'intestin résident les populations uniques de innées et adaptatives des cellules immunitaires qui sont impliqués dans la promotion de la tolérance envers la flore commensale et d'antigènes alimentaires tout en concomitance sur le point restant à monter vers les réponses inflammatoires 1,2 pathogènes invasifs. Cellules présentatrices d'antigènes, en particulier les macrophages, les PED et jouent un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie intestinale immunitaire par leur capacité de détecter et de répondre de façon appropriée le microbiote 3-14. L'isolement efficace des pays en développement intestinales et les macrophages est une étape cruciale pour caractériser le phénotype et la fonction de ces cellules. Alors que de nombreuses méthodes efficaces d'isoler les cellules immunitaires intestinales, y compris les pays en développement et les macrophages, ont été décrits 6,10,15-24, beaucoup comptent sur les temps des digestions longues qui peuvent influencer négativement l'expression des antigènes de surface cellulaire, la viabilité cellulaire, et / ou le rendement des cellules. Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide d'un grand nombre de viable, les PED intestinales et les macrophages. La caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée par coloration directe isolés cellules intestinales avec spécifiques marquées par fluorescence des anticorps monoclonaux pour l'analyse des flux multi-couleurs cytométrie. En outre, DC de haute pureté et les populations de macrophages sont isolés pour des études fonctionnelles utilisant CD11c et CD11b perles de cellules activées de tri magnétique suivi par le tri cellulaire.
Protocol
1. Dissection et dissociation des cellules épithéliales intestinales
Préparation des réactifs et du matériel:
- Chaude Ca 2 + / Mg 2 + sans PBS (FMC PBS) à la température ambiante.
- Chaud Ca 2 + / Mg 2 +-libres HBSS avec 5% de FBS (HBSS CMF / FBS) et 2 mM EDTA à température ambiante.
- Chaud Agitateur orbital à 37 ° C.
Remarque: Les étapes 1.1 à 1.7 doit être effectuée aussi rapidement que possible afin de minimiser l'étendue de la mort cellulaire et pour obtenir un rendement cellulaire maximale.
- Euthanasier les souris dans un chambre de CO 2 et d'éthanol de pulvérisation de 70% sur l'abdomen et du thorax.
- Faire une petite incision horizontale au milieu de l'abdomen avec une paire de ciseaux et peler la peau pour exposer le péritoine.
- Passez à séparer l'estomac de l'intestin grêle supérieur en coupant au niveau du sphincter pylorique. Tease loin du mésentère avec des pinces et couper de nouveau àde la valvule iléo-caecale pour libérer tout l'intestin grêle du gros intestin. Faites une entaille à la marge de l'anus et encore démêler le mésentère jusqu'à ce que le gros intestin est libre.
- Couper le côlon longitudinalement l'aide de ciseaux et rincer le contenu fécaux et de mucus dans la lumière intestinale dans le CMF PBS à température ambiante.
- Utilisez des ciseaux et des pinces à disséquer macroscopiquement les plaques de Peyer le long de la surface anti-mésentérique de l'intestin grêle et coupés de l'intestin grêle longitudinalement.
- Laver les lumière de l'intestin grêle des matières fécales et de mucus dans CMF PBS à température ambiante.
- Par ailleurs coupé l'intestin grêle / de grande taille en pièces d'environ 1,5 cm et les placer dans des tubes séparés 50 ml coniques contenant 30 ml de pré-chauffée HBSS CMF / FBS et 2 mM EDTA. Ne pas ajouter plus de 1 intestin par 50 ml tube conique.
- Horizontalement placer chaque tube conique de 50 ml dans un agitateur orbital et agiter pendant à 250 rpm pendant 20 min à 37 ° C </ Li>
- Placez une passoire unique fil sur un seau de déchets et verser le contenu de chaque tube conique de 50 ml par de récupérer les 1,5 pièces cm de l'intestin et les placer dans différents tubes coniques de 50 ml contenant 30 ml de préchauffées CHBSS / FB avec 2 mM d'EDTA.
- Répétez 1.8.
2. Digestion du tissu et l'isolement des cellules intestinales
Préparations à base de réactifs et d'équipements:
- Solution de collagénase: 1,5 mg / ml Type VIII collagénase dissous dans préchauffé HBSS CMF / FBS avec 40 pg / ml de DNase I.
- Préchauffé HBSS CMF / FBS et 2 mM EDTA.
- Préchauffé agitateur orbital à 37 ° C.
- Ice-froid HBSS CMF / FBS.
- Après le second tour de la secousse, versez les contenus de chaque tube de 50 ml conique à travers le filtre et transférer 1,5 pièces cm de l'intestin à un petit plastique pèsent bateau après tamponnant loin des médias en excès en utilisant une serviette en papier.
- Rapidement émincer le 1.5 Pièces cm de l'intestin à l'aide de ciseaux directement dans le bateau de poids et d'ajouter l'intestin hachées 20 ml de solution de collagénase. Horizontalement placer chaque tube conique de 50 ml dans un agitateur orbital et faire digérer à 200 rpm pendant 10-20 min à 37 ° C. S'il vous plaît voir ci-dessous portant sur l'optimisation.
- En bref vortex pour s'assurer la dissociation complète de tout tissu restant intestinale et le filtre à travers une passoire 100 um cellules directement dans un tube de 50 ml conique.
- Haut de chaque tube conique de 50 ml avec du HBSS CMF / FBS et centrifuger à 1500 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Si un solide culot n'est pas observée pour les échantillons du côlon après centrifugation, les échantillons doivent être centrifugés à nouveau de 3,5 min. Répétez cette étape de lavage une fois de plus.
- Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans glacée HBSS CMF / FBS et des échantillons de placer sur la glace.
- Passez à la section 3 pour l'acquisition de FACS / analyse ou de la section 4 pour magnétique talon d'enrichissement pour la cellule haute-vitesse Sorting.
3. Coloration des anticorps pour l'analyse des flux multi-couleur par cytométrie de pays en développement et les macrophages
Préparations à base de réactifs et d'équipements:
- Ice-froid CMF PBS.
- Tampon de coloration glacée (CMF PBS + 5% de FBS).
- Préparer cellules mortes tache dans glacée CMF PBS à 1:1000 dilution à l'aide LIVE / DEAD Kit fixable Aqua Dead Cell taches.
- Préparer le cocktail d'anticorps coloration en ajoutant les suivantes marquées par fluorescence des anticorps monoclonaux (mAb) à la glace froide tampon de coloration: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, CMH-II (IA b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.
- Transfert des cellules dans un 5 ml polystyrène à fond rond (FACS) du tube.
- Laver les cellules deux fois dans la glace froide CMF PBS.
- Échantillons Incuber avec cellule morte tache pendant 15 min sur la glace dans l'obscurité.
- Laver les cellules deux fois dans la glace froide CMF PBS.
- Cellules de bloc avec 2.4G2 anti-FcγRIII/II dans glacée colorationtampon pendant 10 min sur la glace.
- Laver les cellules dans un tampon de coloration glacée.
- Incuber les échantillons avec un cocktail d'anticorps coloration pendant 20 min sur la glace dans l'obscurité.
- Laver les cellules avec du tampon glacé coloration à deux reprises et remettre en suspension des échantillons dans 400 ul de tampon glacé coloration et passer à travers bouchon 40 um filtre sur tubes FACS.
- Acquérir des échantillons sur LSR II cytomètre (BD) tels que définis par la stratégie de porte à la section 5 et la figure 1.
4. Enrichissement des pays en développement et les macrophages de l'intestin
Préparations à base de réactifs et d'équipements:
- Tampon de coloration glacée (CMF PBS + 5% de FBS).
- Incuber la suspension cellulaire unique obtenue à l'étape 2.5 avec CD11b et CD11c perles MACS selon les instructions du fabricant.
- Laver les cellules avec un tampon de coloration glacée suivie d'une centrifugation.
- Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon coloration glacéeet passer à travers une passoire 100 um cellulaire suivie d'une passoire cellule 40 um.
- Enrichir pour billes magnétiques joints par sélection positive des cellules en utilisant MACS LS colonne magnétique.
- Répétez l'étape 4.2 et éliminer le surnageant.
- Incuber les cellules avec des mAbs marqueurs de surface tels que décrits à l'étape 3.7.
- Lavez-bille magnétique enrichis cellules deux fois avec tampon de coloration glacée. Remettre en suspension les culots de cellules dans 500 ul tampon de coloration glacée sans l'azoture de sodium, et de passer à 40 um tamis cellulaire dans un tube FACS.
- Passez à la FACS-tri sur la trieuse de BD ARIA II cellulaire pour trier DC intestinale et / ou sous-ensembles de macrophages d'intérêt.
5. Stratégie d'ouverture de porte pour LP APC
Note: S'il vous plaît noter que les cellules intestinales non colorées peuvent être utilisées comme contrôle négatif pour aider à la mise en place correcte des portes pour séparer les populations positives et négatives.
- Comme le montre la figure1, créez un tracé de points et exclure les cellules qui sont positives pour la cellule morte tache (fig. 1A), suivie par l'exclusion d'événements doublet (Fig. 1B et C). Puis, la porte sur les cellules d'intérêt en fonction de transmettre et de diffusion latérale en veillant à exclure les débris (Fig. 1D).
- Créez un autre tracé de points et porte en outre sur les CD45 + et IA b + cellules, ce qui caractérise phénotypiquement APC (Fig. 1E).
- Sur un tracé de points distincts, d'analyser et d'expression pour CD11b CD11c de distinguer DC spécifique et sous-ensembles des macrophages (R1, R2 et R3; Fig. 1F). Les cellules de R1 sont CD11c + CD11b ternes / - cellules. La région, R2, est délimité de telle sorte que ces cellules ont des niveaux similaires de l'expression en surface de CD11c comme dans les cellules de R1, mais les cellules de R2 expriment également CD11b. Par la suite, la région R3 est désigné pour les cellules qui sont + CD11b et terne / CD11c -.
- Unalyze régions R1, R2, R3 et autre expression pour F4/80 et CD103 pour différencier des macrophages et des populations de DC, respectivement. Le CD11c + CD11b terne / - cellules expriment des niveaux de R1 élevés de l'intégrine αE, CD103, et de faibles niveaux de F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + cellules de R2 sont composés de deux contrôleurs et des macrophages sur la base de leur expression dichotomique de CD103 et F4/80 (figure 1H). Enfin, CD11b + CD11c ternes / - cellules de macrophages constituent R3 basées sur le profil phénotypique de F4/80 + et CD103 - (Fig. 1I) 16.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1. Stratégie d'ouverture de porte pour les PED intestinales et les macrophages. Cellules mortes (A) et doublets (B et C) ont d'abord été exclus de l'analyse, puis petite intestinalecellules internes ont fermée en conséquence de transmettre et de côté de dispersion (D), et CPA ont été défini comme CD45 + b + IA (E). Les macrophages et les PED ont été identifiés par l'expression de CD11b et CD11c (F). CD103 et F4/80 expression pour les cellules pré-dépendants sur R1 (G), R2 (H) et R3 (I), les populations ont été analysées.
Figure 2. Rendement cellulaire et qualité de la coloration d'anticorps dépend du temps de digestion. CD11b et CD11c motif de coloration et le rendement total de cellules de la sous-(A, D), de façon optimale (B, E) ou sur-digéré (C, F) du tissu intestinal.
Les cellules intestinales ont été isolés à partir d'un intestin souris C57BL / 6 petites et pays en développement et les macrophages ont été analysées par FACS sur la BD LSR II. Tension et de compensation ont été définies à l'aide non colorées et seul fluorochrome tachés de splénocytes. Les cellules mortes (Fig. 1A) et doublets (Fig. 1B et C) ont d'abord été exclus del'analyse. Les cellules d'intérêt ont ensuite été analysées en fonction de transmettre et le côté de dispersion (Fig. 1D), suivie par de déclenchement sur CD45 + et IA b + cellules (Fig. 1E). Par la suite, CD11b et CD11c expression a été évaluée chez le CD45 + b + IA cellules pour délimiter trois régions (R1, R2 et R3; Fig. 1F). CD103 et F4/80 expression dans les trois régions a été évaluée à la distinction entre les pays en développement et les macrophages, respectivement. Le CD11c + CD11b / terne - les cellules de R1 ont exprimé des niveaux élevés de l'intégrine αE, CD103, et de faibles niveaux de F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + cellules de R2 ont été composé de deux contrôleurs de domaine et les macrophages en fonction de leur expression et dichotomique de CD103 F4/80 (Fig. 1H), tandis que CD11b + CD11c ternes / - cellules de macrophages constituent R3 basées sur le profil phénotypique de F4 / 80 + et CD103 - (
La relation entre la durée de la digestion du tissu sur le rendement total de cellules et l'expression de CD11b et CD11c est illustré à la figure 2. Tissu intestinal qui a été digéré pendant 3 min (sous-digestion) a donné le faible nombre total de cellules (Fig. 2D) et les PED et les macrophages donc peu disponibles pour la caractérisation (figure 2A). Digestion du tissu pour 11 min a produit un rendement robuste de cellules vivantes (Fig. 2E) avec les populations de pays en développement et les macrophages qui expriment des niveaux élevés de CD11b et CD11c et phénotypiquement distincte (Fig. 2C). En revanche, la digestion pendant 50 min (plus-digestion) a entraîné un rendement cellule similaire en cas de compared à la digestion optimisée (Fig. 2E et F), cependant, la délimitation des différentes populations de cellules en utilisant CD11b et CD11c est devenu plus obscur que l'expression de CD11c diminuée (Fig. 2C) et le nombre de cellules mortes a augmenté (données non présentées).
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Discussion
Figure 3. Facteurs importants pour l'optimisation du rendement des cellules et l'expression des antigènes de surface. Rendement cellulaire et l'expression des antigènes de surface sont directement touchés par la durée de la digestion des tissus, les caractéristiques spécifiques de la collagénase, le degré de tissus, de hachage et la présence ou l'absence d'inflammation, ce qui peut affecter l'intégrité des tissus et de la cellularité. Digestion du tissu prolongée peut provoquer de la viabilité cellulaire a diminué et l'expression antigène de surface alors que la digestion insuffisante des tissus peut entraîner une pénurie de cellules d'analyse.
Ici, nous avons détaillé une méthode pour l'isolement rapide des pays en développement de la souris intestinales et les macrophages pour la caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multi-couleur et pour l'enrichissement de l'aide de billes MACS et de tri cellulaire pour effectuer des études fonctionnelles sur cellules purifiées. Optimisation de la concentration de la collagénaseet la durée de la digestion du tissu est nécessaire pour produire un rendement cellulaire sans compromettre la viabilité robuste et expression de l'antigène de surface. Sous-digestion donne un nombre de cellules à faible total et un manque de contrôleurs de domaine et les macrophages de caractérisation (Fig. 2A et D). D'autre part, au cours de digestion donne un nombre total de cellules semblables à des conditions optimisées (Fig. 2F), mais le nombre de cellules mortes sont sensiblement augmenté (données non présentées) et de la qualité de la coloration est compromise. Semblable à la sous-digestion, la sur-digestion des tissus ne ferait que compliquer la caractérisation phénotypique et de purification.
Plusieurs paramètres supplémentaires pour examen à l'aide de ce protocole sont le fabricant, le type et lot spécifique de la collagénase, l'intégrité et de la cellularité de l'intestin, et le degré de tissus hachage. Comme la variabilité dans les activités de la collagénase peuvent exister entre les différents fabricants, les types de collagénase, et lo productionts, la puissance de la digestion peuvent varier considérablement et nécessite une optimisation. Ainsi, le choix du type le plus approprié de la collagénase est essentiel lors de la conception d'une expérience que la qualité et la reproductibilité des données peut être affectée. Dans notre expérience, la collagénase de type VIII obtenus auprès de Sigma Aldrich a-donné les meilleurs résultats, cependant, nous avons aussi eu du succès en utilisant collagénase de type IV de Sigma Aldrich.
Bien que le protocole ci-dessus détaillé a été optimisé pour une utilisation sur la santé des intestins de petites et grandes, il peut être utilisé avec succès pour l'isolement de pays en développement et les macrophages de tissu enflammé présentant cellularité accrue et une distorsion architecturale associée à l'inflammation. La présence d'une inflammation intestinale peut considérablement affecter la vitesse de digestion, souvent augmenter la sensibilité du tissu intestinal à l'action d'enzymes protéolytiques sur la base de notre expérience. Par conséquent, la durée de la digestion ou la concentration de la collagénase doit être adaptée en conséquence des changements dans l'intégrité des tissus associés à l'inflammation.
En outre, le degré de hachage du tissu affecte la durée de la digestion de tissu. Mincing le tissu en petits morceaux augmente la surface de la digestion et donne plus de cellules, mais des précautions doivent être prises, comme le tissu peuvent être plus sensibles à la sur-digestion. Par conséquent, la durée de la digestion peut être nécessaire de diminuer. En revanche, hacher les pauvres se traduira par de plus grands morceaux de tissu qui digèrent mal traduit par un rendement total de cellules à faible. L'augmentation de la durée de la digestion peuvent compenser pour hacher les pauvres dans une certaine mesure.
Sur l'optimisation des paramètres pour la digestion des tissus intestinaux avec de la collagénase, un rendement de cellules robustes puissent être rapidement réalisées. En conséquence, DC intestinale et les populations de macrophages peut être plus précisément caractérisé et purifié pour des études fonctionnelles pour évaluer cytokinela production, la présentation des antigènes, et la régulation des cellules immunitaires.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Aaron Rae (Emory University Département de pédiatrie et des soins de santé pour enfants de Core flux Atlanta) pour le tri cellulaire. Ce travail a été soutenu par le NIH subvention AA01787001, une bourse de perfectionnement de carrière de la maladie de Crohn et la colite Foundation of America, et un enfants Emory-Egleston de recherche de semences Centre subvention pour TLD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free | |||
| Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red | Fisher Scientific | SH3001603 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza Inc. | 17-737E | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | Heat-inactivated |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| DNase I | Roche Group | 14785000 | Stock solution: 100mg/ml |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation | Invitrogen | L34957 | Use at 1:1000 |
| CD45-PerCP mAb (30F11) | BD Biosciences | 557235 | Use at 1:100 |
| CD103-PE mAb (M290) | BD Biosciences | 557495 | Use at 1:100 |
| FcγRIII/II mAb (2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | Use at 1:200 |
| CD11c-APC mAb (N418) | eBioscience | 17-0114-82 | Use at 1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb | eBioscience | 56-5321-82 | Use at 1:100 |
| CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) | eBioscience | 48-0112-82 | Use at 1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) | eBioscience | 25-4801-82 | |
| CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| CD11c microbeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | |
| 50 mL conical tubes | BD Biosciences | 352098 | |
| Single mesh wire strainer | Chefmate | ||
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-116 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352235 | Use at 1:100 |
| MaxQ 4450 benchtop orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSR II | BD Biosciences | ||
| FACSAria II | BD Biosciences |
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