利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

摘要

通过联合使用BrdU对核酸进行代谢标记以及碘化丙啶对总基因组DNA染色，可实现对细胞周期各阶段进展及动力学的细微变化进行追踪。该方法无需对增殖细胞进行化学同步化处理，从而避免了非特异性DNA损伤的引入，进而防止对细胞周期进程造成影响。

摘要

在增殖细胞中，精确控制细胞周期各个阶段的起始及后续进程至关重要。细胞周期分裂是生长和繁殖的固有组成部分，关键细胞周期组分的失调已被认为与致癌事件的发生密切相关^1,2。抗癌治疗中的分子靶向药物常作用于调控和协调细胞周期分裂的生物学通路³。尽管细胞周期动力学通常因细胞类型不同而有所差异，但由于有丝分裂原和生长因子表达模式的一致性，特定细胞系中细胞在细胞周期四个阶段的分布相对稳定。基因毒性事件及其他细胞应激因素可导致细胞周期进程的暂时性阻滞，使细胞停留在某一特定细胞周期阶段，以启动相应的应答机制。

能够通过实验观察细胞群体在细胞周期进展不同阶段的行为，是细胞生物学领域的一项重要进展。常用的方法包括有丝分裂摇落法、差速离心法或基于流式细胞术的分选技术，用于分离处于细胞周期特定阶段的细胞^4-6。随后，将这些经过分离、富集了特定细胞周期时相的细胞群体用于实验处理。然而，这些物理分离方法常常会影响所获得细胞组分的得率、纯度和活力。此外，细胞群体分离后到实验处理开始之间的时间延迟，可能导致已分离的细胞离开原本选定的细胞周期阶段，从而为实验的顺利实施和结果的准确解读带来显著挑战。

研究细胞周期阶段的其他方法包括使用化学物质来同步细胞。通过使用针对每个细胞周期阶段关键代谢过程的化学抑制剂处理细胞，可有效阻断细胞周期向下一阶段的进程。例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂羟基脲通过限制脱氧核苷酸（DNA的基本组成单位）的供应，使细胞停滞在G1/S交界处。其他重要的化学物质还包括：使用DNA聚合酶α抑制剂阿非迪可林诱导G1期阻滞；使用秋水仙素和诺考达唑处理，二者均可干扰有丝分裂纺锤体的形成，从而使细胞停滞在M期；最后，使用DNA链终止剂5-氟脱氧尿苷诱导S期阻滞^7-9。这些化学物质处理是将整个细胞群体同步于特定阶段的有效手段。去除化学物质后，细胞会同步重新进入细胞周期。在解除细胞周期阻滞之后再给予待测药物处理，可确保所观察到的药物反应来自处于同一细胞周期阶段的均一群体。然而，由于许多化学同步剂本身是已知的具有基因毒性的化合物，因此区分不同应答通路的激活原因（是由同步剂还是由待测药物引起）具有挑战性。

本文介绍了一种代谢标记方法，用于追踪处于活跃增殖状态的细胞亚群，观察其从DNA复制阶段开始，直至子细胞分裂与分离的整个过程。结合流式细胞术进行定量分析，该方案能够在无需采用机械或化学方法诱导细胞应激的条件下，实现对细胞周期动力学进程的测量，而此类细胞应激通常与其他细胞周期同步化方法相关联¹⁰。在后续章节中，我们将讨论该方法的技术细节及其在生物医学研究中的一些应用。

方案

1. 细胞准备

1. 以每10 cm培养皿接种5 × 10⁵个细胞的密度接种MCF7细胞，或以每6 cm培养皿接种6 × 10⁵个细胞的密度接种HT29和....

讨论

通过结合流式细胞术与溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法，我们具备了研究细胞周期动力学所需的必要工具。BrdU能够作为胸腺嘧啶核苷类似物的独特性质，使其可用于定量分析增殖细胞的DNA含量。在细胞周期的合成期（S期），BrdU被掺入正在延伸的子代DNA链中，这一特性使得研究人员能够追踪一群增殖细胞，从S期的DNA复制，经过G2期的生长阶段，最终进入细胞分裂。子代BrdU阳性细胞可被持续追踪，直至细胞分裂导致BrdU标记被稀释到信号降低至背景水平为止。

利用碘化丙啶测定总DNA含量，我们能够追踪细胞周期从S期→G2/M期→G1期的进程。在多种应用中，尤其是涉及细胞周期特异性DNA损伤诱导药物的临床前研究，或在药物开发过程中确定新化合物对不同细胞周期阶段敏感性时，监测细胞周期速率的能力具有重要意义和实用价值¹¹。采用代谢标记技术最明显的优势在于无需使用化学方法对细胞进行同步化处理。由于大多数诱导细胞周期阻滞的化学处理本身具有基因毒性，因此在这些化学物质存在的情况下，难以准确解析新化合物对细胞周期敏感性的影响。

我们通过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溴脱氧尿苷	BD Biosciences	55089
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	287075	1mg/ml 储存液
FITC 标记抗 BrdU 抗体	BD Biosciences	347583
四硼酸钠	Fisher Scientific	S80172	0.1M，pH 8.5
FACS Caliber	BD Biosciences