Summary
שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ"א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.
Protocol
1. תא הכנה
- תאים הצלחת להשיג צפיפות של כ 60% confluency. התאים חייבים להיות בשלב יומן בעת האיסוף. עבור mcf7 תאים, עושים זאת על ידי זריעה על 5 x 10 תאים 5/10 ס"מ צלחת באמצעי התקשורת המתאימים. HT29 ו LS180 תאים זרע לאחר 6 x 10 תאים 5/6 צלחת ס"מ. השתמשנו DMEM התקשורת השלימו עם 10% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. הקפד צלחות זרע שולטת חיוביות ושליליות הנכונותבנוסף דגימות הבדיקה שלך. הם כוללים:
| אני | בקרה חיובית | BrdU בלבד |
| ב | בקרה חיובית | לצרכן בלבד |
| ג | בקרה שלילית | BrdU שלילית, PI שלילית |
(יש לציין כי ניסוי ראשוני עם timepoints מרובים כמו זה שמתואר בפרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לצמצם את מסגרת הזמן שבו לבצע את האוספים הבאים.)
- התאים מצופה מודגרת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 של 24-48 שעות, ובכך לאפשר לתאים להתאושש לצרף.
- לדופק תאים תווית עם bromodeoxyuridine (BrdU), DMEM מוחלף Wiהתקשורת טריים המכילים 10 מיקרומטר ה BrdU. תאים מודגרת עבור 1 H ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, כדי לאפשר שילוב BrdU לתוך ה-DNA. הקפד להשאיר צלחת 1 מטופל לשמש בקרת שלילית.
- הדופק תיוג התקשורת מוסר לבין תאים שטף בקצרה עם 1X PBS.
- התקשורת הצמיחה טריים נוסף (מינוס BrdU) ותאי מותר להמשיך לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד timepoint מתאים קצירת הוא הגיע.
2. קציר קיבוע
- בתאים שלא טופלו משלב 1.3 נחשבים timepoint אפס. מדגם זה ניתן לקצור יחד עם 1 H timepoint אשר נאסף מיד לאחר הטיפול BrdU.
- כדי לקצור את התאים, מדיה מוסר והצלחות הם שטף פעם אחת עם 1X PBS.
- תאים trypsinized, אסף בתקשורת culturing ו pelleted לאחר מכן על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 עבור 5 דקות סופernatant נמחק.
- יש לשטוף 1-10 x 10 6 תאים 5 מ"ל קרח קר 1X PBS. סרכזת בסל"ד 1500 עבור Supernatant 5 דקות נמחק.
- תא גלולה הוא resuspended אז μl 100 של קר כקרח PBS / 1% FBS. תוספת של 1% FBS PBS מסייע במניעת clumping התא.
- הוסף ירידה תאים אלה על ידי ירידה של 5 מ"ל ל -20 ° C, 70% אתנול לתקן את התאים.
- דגירה על קרח למשך 30 דקות או בחנות ב 4 ° C למשך הלילה. זהו צעד אידיאלי שבו להפסיק איסוף דגימות מן timepoints שונים. דוגמאות ניתן להשאיר באתנול במשך כמה ימים, ולאפשר להם להיות מעובד בו זמנית באמצעות יתרת לפרוטוקול.
3. BrdU ו PI מכתים
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות בסל"ד 1500.
- הסר מקבע, אבל להשאיר ~ 50 μl בו כדי לשחרר את הכדור על ידי vortexing.
- כדי לפגל את ה-DNA, לאט להוסיף 1 מ"ל של HCL 2N / טריטון X-100dropwise תוך vortexing. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה דגימות 5 דקות בסל"ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant.
- Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של 0.1M נתרן tetraborate, pH 8.5, לנטרל את הצעד denaturation.
- סרכזת תאים 5 דקות בסל"ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant.
- Resuspend תא גלולה ב μl 75 תמהיל מכתים BrdU (50 0.5% μl tween 20/1% BSA / PBS + 20 μl FITC מצומדות נגד BrdU + 5 μl 10 מ"ג / מ"ל RNase).
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות מפני האור.
- לתאים גלולה, צנטריפוגות מדגמים דקות 5 בסל"ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant.
- Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל propidium יודיד.
4. תזרים Cytometry
- כדי לנתח את התאים, cytometer זרימת מצויד לייזר 488 ננומטרמסננים מתאימים הוא הכרחי. תוכנת ניתוח כגון CellQuest יש ליצור החלקות המפורטות להלן.
- כאשר פועל באמצעות מדגם cytometer את זרימת, ליצור פיזור קדימה (SSC-H) לעומת הצד פיזור (FSC-H) העלילה כדי להבטיח את התפלגות גודל תקין של התאים (איור 1 א). שני פרמטרים אלה נרשמות על בקנה מידה ליניארי.
- במקביל להצגת חלקת FL3-H (PI כתם) לעומת fl2-W (1B איור). עלילה זו משמשת ליצירת השער (R3) כדי לבודד את החלק היחסי של תאים הנמצאים בתוך דפוס ההתפלגות הנורמלית של מחזור התא. באופן כללי, דפוס זה מאופיין על ידי חלוקת שני אשכולות של תאים מתוכן את ה-DNA של 2N ו 4n מכתים לצרכן מייצג את ה-G1 ו G2 של שלבי מחזור התא, בהתאמה. שורה של תאים הממוקמים בין 2 קבוצות הוא נציג של שכפול ה-DNA מתמשכת המתרחשת בשלב S של מחזור התא.
- צור displayi העלילהng התאים סגורות (R3) של 4.3 צעד, עם FL1-H (FITC, העלילה יומן) על ציר y ו - PI (העלילה ליניארי) על ציר x (איור 1 ג). העלילה זה ישמש כדי לקבוע את הפרמטרים הנותרים באמצעות הפקדים השונים המתוארים 1.1, וכן כדי לאסוף נתונים לצורך ניתוח.
- מניחים את PI רק דגימה מוכתמת על cytometer. התאם רווח להציב G1 ב ~ 200 על ציר ה-x. זה יהיה קל יותר לדמיין בעלילה היסטוגרמה של PI הכתם.
- פקד 2 כרוך פועל מדגם BrdU בלבד על cytometer את הזרימה. התאם רווח כך 2 אוכלוסיות של תאים (BrdU חיובית לעומת BrdU שלילי) נראה על המגרש. באופן אידיאלי, התאים BrdU שליליות ממוקמים להופיע מתחת 10 -1.
- השליטה הסופית היא מדגם BrdU / PI שלילית. הפעל בקרה שלילית על מנת להבטיח כי התאים אינם מופיעים בכל אחד הרביעים העליונה או ימינה.
- לאחר הפרמטרים של החלקות השונות נקבעו,cytometer הזרימה הוא מכויל ומוכן לעיבוד של תאים BrdU ו PI מוכתמים. מינימום של 10,000 תאים הנמצאים מגודרת בשבריר לצרכן הנכון (מתייחס לשלב 4.3) יש לקרוא לכל אוסף.
- כדי לנתח את הנתונים שנאספו, תוכנה כגון FlowJo או FacsDiva מנוצלים. כל החלקות הנ"ל ניתן ליצור מחדש בתוכניות אלה וניתוח כמותי סטטיסטי ביצע.
- נקודת הסיום של ניתוח כולל כמה שלבים רצופים. יצירת חלקת FITC לעומת PI עם תאים סגורות כמו PI חיובית העלילה לצרכן לעומת fl2-W מאפשר להבחין בין האוכלוסייה רכיבה על אופניים. שער 2 נוצרת העלילה זה על ידי בידוד האוכלוסייה BrdU חיובית. להביע את האוכלוסייה הייחודי על מגרש היסטוגרמה עם PI על ציר ה-x מאפשר לעקוב אחר מהלך הזמן של התקדמות מחזור התא. זה יכול להיות דמיינו עוד יותר על ידי מתכנן מספר BrdU חיובי תאים עם G1 או תוכן G2 כפונקציה של הזמן.
5. נציג תוצאות
בדרך כלל תאים אופניים מוכתמים יודיד propidium יש שיאים שונים ב G1 ו G2, המתאימים תאים המכילים תוכן DNA 2N ו 4n, בהתאמה (איור 2). הדופק סימון BrdU מאפשר תיוג סלקטיבית של אוכלוסיית משנה של תאים באופן פעיל סינתזה DNA (שלב S IE). זמן קצר לאחר הסרת מגיב BrdU, כל התאים המסומנים נמצאים בשלב S (איור 3). על ידי הגבלת תיוג לדופק קצר אחד הוא מסוגל לעקוב אחרי זה ברור עכשיו תת אוכלוסיה של תאים בכל נקודות זמן רב כשהם עוברים דרך השלבים הבאים של מחזור התא. זה יכול להיות דמיינו בנקודה H 1 זמן באיור 3 כחוסר הברור של ה-G1 ו G2 פסגות.
מידע נוסף ניתן להסיק בשלב תיוג BrdU. לא רק יכול חלקם של התאים המתחלקים באופן פעיל להימדד, אבל ESTimate ההפצה מחזור התא בשלב בין שתי דגימות ניתן לקבוע גם כן. על ידי איסוף תאים במרווחים גדולים לא פחות לאחר הסרת מגיב BrdU, ניתן לאתר תאים כאשר הם ממשיכים בהתקדמות מחזור, כדי G2, ובסופו של דבר לעבור כדי חלוקת התא של התאים המקוריים, סוף סוף מתעוררים כמו BrdU חיובי לתאי הבת עם G1 ה-DNA תוכן (איור 4). דוגמה כימות מחזור התא בשלב וניתוח הקינטית ניתן באיור 5.
איור 1 (א) פיזור קדימה לעומת פיזור מגרש הצד של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. (ב) לצרכן לעומת רוחב (FL-W) מגרש של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. Gating מוצג להוציא כפילויות התא בסופו של דבר (R3). כפילויות התא יהיה רוחב הדופק עולה על תא בודד, כפי שהם דורשים זמן רב יותר לעבור דרך קרן לייזר ו therefעפרות ניתן לשלול מן הניתוח. (ג) PI לעומת FITC (BrdU) מגרש של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. Gating מוצג לכלול רק את (BrdU) תאים FITC חיוביות (R4).
איור 2. היסטוגרמה נציג חלקת אוכלוסייה של תאים בדרך כלל אופניים.
איור 3. העלילה היסטוגרמה של התאים שנאספו 1h לאחר הסרת הדופק BrdU, לאחר gating עבור FITC (BrdU) חיובי תאים. BrdU חיובי תאים ב timepoint מוקדם לאחר הסרת התווית הצגת פרופילים לצרכן המתאימים דגימות DNA המציגים תוכן בקנה אחד עם תאים הנמצאים בשלב-S של מחזור התא, המאשר תיוג מוצלח של תאים רק במהלך סינתזת ה-DNA.
LT = "איור 4" />
איור 4. השוואה של מחזור התא קינטיקה התקדמות בין שורות תאים סרטניים, סרטן המעי הגס HT29 (א) ו LS180 (ב '), כמו גם סרטן השד mcf7 (C). תאים נאספו כל שעה במשך 8 שעות, בעקבות הסרת הדופק BrdU. בניסוי זה, צפינו על פרופיל ברור של התפתחות תאים מואצת לעבור שלב G2 של מחזור התא LS180 תא המעי הגס קו. השוואת קינטיקה בין שני פרופילים של תאים סרטן המעי הגס, הופעת שיא G1 ניכר ב ט = 4H שלאחר BrdU ב LS180 תאים, לעומת נקודת הזמן המתאימה לקו HT-29 בתא שבו אין זה השיא. בהשוואה בין אחת משתי שורות תאים המעי הגס, mcf7 תאים רכיבה על אופניים בקצב משמעותי. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
מחדש 5 "/>
איור 5 (א) תא כמותי מחזור שלב ניתוח BrdU, שכותרתו תאים סרטניים. האלגוריתם דין / ג'ט / פוקס היה מוחל על HT29, LS180 ו mcf7 (מאויר בירוק). מחזור וכתוצאה מכך על תאים בשלב הפצות מכל מדגם מבוטאות% מסך BrdU חיובי תאים עבור כל שלב. רק לבחור נקודות זמנים לקו כל תא מוצגים, כמו ניתוחים של כמה נקודות זמן קודמות הניבו תוצאות לא חוקיים. אלה נקודות הזמן קודמות, כל BrdU חיובי תאים הם בשלב-S ולכן אין G1 ברורים פסגות G2, אשר נחוצים יישום אלגוריתם. (ב) Histograms של תאים סרטניים מראה את הקינטיקה של התקדמות דרך G2 / M שלבי מחזור התא. התקדמות דרך G2 / M שלבים הוא המהיר ביותר LS180 התאים, ואחריו HT29 ו mcf7. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
"alt =" jpg איור S1 "/>
איור S1. Cytometry בקרות זרימה. mcf7 תאים מוצגים הביקורת (A) שלילי שבו התאים הם לא לצרכן ולא מוכתם BrdU. (ב) לצרכן מוכתם בלבד. (ג) BrdU-FITC שכותרתו דגימות.
איור איור S2. סכמטי המציג את הקשר בין ספקטרום פליטה הניאון של PI לעומת FITC (BrdU). החלונות איסוף ספקטרליים עבור ערוץ ניאון 1 (FL1, עבור FITC) וערוץ ניאון 3 (FL3, עבור PI) מוצגים בתיבות המתאימות. אין חפיפה בין ספקטרום fluorophore FL1 ו FL3 זיהוי. ככל הנראה, פיצוי הקרינה אינו הכרחי כאשר נתוני הניסוי של PI ו FITC-BrdU שיתוף שכותרתו התאים נאספים על FL1/FL3 ערוצי בהתאמה. ספקטרום הקרינה התקבלו באתר BioSciences BD:target = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על ידי שילוב של cytometry זרימה עם שילוב BrdU, יש לנו את הכלים הדרושים כדי ללמוד קינטיקה מחזור התא. המאפיין הייחודי של BrdU לתפקד אנלוגי תימידין מה מאפשרת כימות DNA תוכן התא רכיבה על אופניים. שילוב של BrdU לתוך גדיל DNA צומח הבת בשלב הסינתזה של מחזור התא היא מה מאפשר לעקוב subpopulation של תאים אופניים באמצעות שכפול של דנ"א בשלב S, לתקופה של צמיחה ב G2, ובסופו של דבר חלוקת התא . הבת BrdU חיובי תאים ניתן בעקבות ברציפות עד אשר נקודת זמן את התווית BrdU מדוללת על ידי חלוקת התא במידה שבה האות פוחת לרמות הרקע.
באמצעות יודיד propidium לקבוע תוכן ה-DNA הכולל, אנו יכולים לעקוב אחר התקדמות מחזור התא מ S → G2 / M → G1. היכולת לעקוב אחר שיעור רכיבה של תאים חשוב ושימושי ביישומים רבים, בעיקר FOR-קדם קליניים מחקרים שכללו מחזור התא ה-DNA ספציפיים נזק וישכנע סמים או במהלך תהליך פיתוח התרופה כדי לקבוע מחזור התא בשלב הרגישות של תרכובות חדשות 11. היתרון הברור ביותר של שימוש בטכניקת סימון מטבולי הוא ביטול של סינכרון כימי של תאים. כמו טיפולים כימיים כי רוב להשרות מחזור מעצר התא הם עצמם genotoxic, לנתח את מחזור התא רגישות ההשפעות של תרכובות הרומן בנוכחות הכימיקלים האלה לא יכול להיות ריאלי.
הראינו צדדיות של הטכניקה הזו תיוג מטבולית BrdU עם PI שיתוף מכתים. באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו הוכיחו בהצלחה כי הגידול התקדמות מחזור התא דרך שלב G2 / M של מחזור התא ניתן להבחין בתאים אנושיים telomerase שלילי אשר עברו שינוי כדי אילצו ביטוי אנזים 10. בעוד ששיטה זו היא חזקה במדידת הקינטיקה של התא כפי מחזורים throאיכס שלבים מרובים, מגבלה אחת היא אובדן של מידע בעיתוי במהלך המעברים, כמו גם בתוך שלבי G2 ו-M. כמו תאים להמשיך דרך G2 ל M, איננו יכולים להבחין לא רק את שני השלבים, אלא גם את האוכלוסייה G1 משנה, מבוססת אך ורק על תוכן ה-DNA. ביישומים שבהם בידול זה נדרש, ניתן פוטנציאל שיתוף להכתים תאים BrdU שכותרתו עם נוגדנים נגד cyclins או חלבונים תאיים אחרים אשר ביטויים ספציפיים לשלב הרצויה של מחזור התא 12,13. אופטימיזציה נוספת יהיה צורך להבטיח את הנוגדנים cyclin עולים בקנה אחד עם תווית BrdU ו חיסונית מכתים פרוטוקול. באופן אידיאלי, על מנת לבדל כראוי בשלבים שונים של מחזור התא, נוגדנים cyclin כמה עשוי להיות נחוץ כדי תווית שיתוף דגימה אחת בעת ובעונה אחת. המעבדה שלנו עובד על תיוג הפוסט של BrdU הדופק התאים המסומנים עם cyclin B ו היסטון phospho 3 נוגדנים להבדיל בין תאיםבשלב G2 לעומת M של מחזור התא. שיתוף סימון נוגדנים cyclin, בנוסף מכתים PI ו FITC-BrdU באופן משמעותי מעלה את הסיבוך של cytometry זרימת מחומרה וגם לניתוח נתונים (בעיות פיצויים הקרינה) פרספקטיבה. עם כניסתו של הדור החדש של cytometers זרימה, יכולת ההתקדמות שלהם פונקציונליות צריך להקל על חששות אלה טכניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים אנדי ג'ונסון של מרכז מחקר ביו רפואית UBC לקבלת סיוע בניתוח FACS. לחקר הסרטן הגיוס וונג מעבדה ניתן על ידי האגודה למלחמה בסרטן הקנדית Research Institute (ההפעלה מענק # 019250) ומ מהשקעה קרנות מחקר של הפקולטה למדעי התרופות, UBC. JMYW נתמך על ידי הכיסאות מחקר בקנדה סמית מיכאל קרן לקריירה בריאות תוכניות מחקר ופיתוח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | BD Biosciences | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher Scientific | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | BD Biosciences |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F.
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
