מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא למדוד את הקינטיקה וההתקדמות של מחזור התא. התאים הראשונים הם מרדף דופק המסומן ברומו, דאוקסי, אורידין או BRDU, המשולב ב-DNA של התא במקום תימידין. לאחר מכן התאים מוכתמים בנוגדנים נגד BRDU ומנותחים על ידי זרימה ציטומטרית מיד לאחר הצביעה.

רק תאים בשלב S מסומנים כאשר התאים המסומנים מתקדמים במחזור התא ל-G שתיים. הם מתגלים כבעלי ארבעה תכולת NDNA בעקבות מיטוזה. תכולת ה-DNA מצטמצמת לשני N.לפיכך, ניתן להשתמש בניתוח פרופילי הקרינה הנוצרים על ידי זרימה ציטומטרית כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מחזור התא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים אחרים המשתמשים בכימיקלים לסנכרון תאים הוא שאין הפרעות פיזיולוגיות שעלולות להשפיע בטעות על מנגנון חלוקת התא. השתמשנו לראשונה בשיטה זו כאשר הניסיונות שלנו לחקור את קצב התקדמות מחזור התא באמצעות סנכרון כימי הניבו לנו תוצאות בלתי צפויות שהפריעו לניתוח שלנו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא.

לדוגמה, מה הבסיס לשיעורי צמיחה דיפרנציאלית בין סוגי תאים שונים? התחל את הפרוטוקול הזה על ידי דופק צ'ייס תיוג התאים עם BRDU כדי לעשות זאת. התחל על-ידי תיוג לוחית אחת של 10 סנטימטר עבור כל נקודת זמן ועוד אחת עבור כל אחד מהפקדים הבאים.

BRDU רק PI רק BRDU שלילי PI זרע שלילי כל צלחת עם חמש כפול 10 לחמישי. שבעה תאי MCF בתוסף DMEM דוגרים על הלוחות למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר לתאים להתאושש ולהיצמד. ברגע שהתאים מגיעים לשטף של 60%, החלף את המדיום ב-DMEM טרי המכיל 10 מיקרומולר.

BRDU דוגרים על התאים למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 כדי לאפשר שילוב BRDU ב-DNA. הקפד להשאיר צלחת אחת ללא טיפול כדי לשמש כבקרה שלילית או נקודת זמן אפס לאחר שעה. הסר את מדיום תיוג הדופק ושטוף את התאים לזמן קצר עם PBS לנקודות הזמן של שעתיים עד שמונה שעות.

הוסף מדיום גידול טרי והחזיר אותם לחממה. לאחר מכן קצרו מיד את לוחות נקודת הזמן של אפס ושעה כמתואר בסעיף הבא. כדי לקצור את התאים, יש לשאוב את המדיום ולשטוף את הצלחת.

לאחר עם PBS, אז טריפסין מסתכל על התאים כדי לנתק אותם מהצלחת ולאסוף אותם בצנטריפוגה DMEM בשלוש פעמים 90 G למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את התאים בצנטריפוגה PBS קרה כקרח של 1 עד 5 מיליליטר בשלוש פעמים 90 G למשך חמש דקות לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במאה מיקרוליטר קרח.

PBS קר המכיל 1% FBS. ה-FBS מסייע במניעת היווצרות תאים. אחד ההיבטים החשובים ביותר בהליך זה הוא להבטיח שיש לך תרחיף תא בודד מהתאים שנקטפו.

לעובדות. כדי להשיג זאת, אתה יכול להוסיף את התאים שלך ישירות לאתנול טיפה אחר טיפה. זה קריטי לאחר מכן כדי לתקן את התאים, השתמש בפיפטה כדי להוסיף את התאים טיפה לחמישה מיליליטר של קוד קרח.

70% אתנול בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. דגרו את התאים על קרח למשך 30 דקות או אחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. זהו שלב אידיאלי בו ניתן לעצור את איסוף הדגימות מנקודות הזמן השונות, ניתן להשאיר את הדגימות באתנול למשך מספר ימים, מה שמאפשר לעבד אותן בו זמנית לאורך שארית הפרוטוקול לביצוע צביעת BRDU ופרופידיום יודיד.

הסר את התאים מארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה אותם בשלוש פעמים 90 G למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב שואבים את רוב הקיבוע ומשאירים כ-50 מיקרוליטר. ואז מערבולת.

לשחרר את הגלולה כדי לנטרל את הדנ"א תוך כדי מערבולת. הוסיפו לאט מיליליטר אחד של שני HCL Triton X 100 רגילים בטיפה ואז דגרו דגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה של דגימות במשך חמש דקות בשלוש פעמים 90 G לאחר מכן שואפים ומשליכים את הסופרנטנט.

לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של 0.1 נתרן טטרה בוראט מולרי. לאחר הצנטריפוגה, התאים שוב שואפים ומשליכים את הסופרנטנט. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא ב-75 מיקרוליטר של צביעת BRDU.

מערבבים את הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות, מוגנים מפני אור לאחר הדגירה. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה כמו קודם והשעיה מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של PBS המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר לכל פרדיום יודיד. בעת הפעלת הדגימה החיובית PI דרך ציטומטר הזרימה, צור פיזור קדימה לעומת עלילת פיזור צדדית כדי להבטיח את התפלגות הגודל הנכונה של התאים.

יש לשרטט את שני הפרמטרים הללו בקנה מידה ליניארי. צפה בו זמנית בעלילה של FL שלוש H לעומת FL שני W כדי להציג את צביעת PI לעומת רוחב דופק הקרינה. תרשים זה משמש ליצירת הליכה לבידוד חלק התאים שנחשבים בתוך דפוס ההתפלגות הנורמלי של מחזור התא.

באופן כללי, דפוס התפלגות זה מאופיין בשני אשכולות של תאים מתכולת שני N וארבעה NDNA של צביעת PI המייצגים את שני השלבים G אחד ו-G של מחזור התא בהתאמה. מחרוזת תאים הממוקמת בין שני האשכולות הללו מייצגת שכפול DNA מתמשך המתרחש בשלב S של מחזור התא. צור עלילה המציגה את התאים המגודרים עם FL אחד, H או FITC בסולם לוג על ציר Y ו-PI בקנה מידה ליניארי על ציר X.

תרשים זה ישמש לקביעת הפרמטרים הנותרים באמצעות הפקדים השונים וכן לאיסוף נתונים. לצורך ניתוח, הנח את דגימת הכתם היחידה של PI ביציאת הטעינה של ציטומטר הזרימה התאם את הרווח כדי למקם G אחד בכ-200 על ציר ה-x. יהיה קל יותר לדמיין זאת בתרשים היסטוגרמה של כתם ה-PI.

לאחר מכן, הנח את דגימת ה-BRDU היחידה ביציאת הטעינה והפעל. התאם את הרווח כך ששתי אוכלוסיות התאים, BRDU חיובי ושלילי BRDU יופיעו בחלקה. באופן אידיאלי, התאים השליליים של BRDU ממוקמים רק ב-10 או מתחת ל-10

הבקרה הסופית היא הדגימה השלילית של BDU slash PI. הפעל פקד שלילי זה כדי להבטיח שהתאים לא יופיעו באף אחד מהרבעים העליונים או הימניים. לאחר קביעת הפרמטרים של החלקות השונות, ציטומטר הזרימה מכויל ומוכן לעיבוד של BRDU ו-PI. תאים מוכתמים אוספים נתונים ממינימום של 10,000 תאים מגודרים PI עבור כל דגימה.

לאחר מכן באמצעות תוכנה כגון FlowJo או דיוות פקס, צור עלילה של FITC לעומת PI עם תאים מגודרים כחיובי PI מתרשים PI לעומת FL שני W. להבחין בין אוכלוסיית הרוכבים. לאחר מכן, צור שער שני לבידוד האוכלוסייה החיובית ל-BRDU.

לאחר מכן כדי לעקוב אחר מהלך הזמן של התקדמות מחזור התא, שרטט את מספר התאים החיוביים של BRDU עם תוכן G אחד או G שניים כפונקציה של זמן כדי להשוות את מחזור התקדמות התא. קינטיקה בין שני קווי תאי המעי הגס HT 29 ו- LS 180. התאים נאספו כל שעה במשך שמונה שעות לאחר הסרת הדופק A-B-R-D-U.

בהשוואת הקינטיקה של שני הפרופילים, הופעתו של שיא G אחד ניכרת ב-t שווה לארבע שעות לאחר BRDU בתאי LS 180 בהשוואה לנקודת הזמן המקבילה לקו התאים HT 29, שחסר שיא זה. זה מצביע על התקדמות מואצת של מחזור התא דרך השלב השני G של מחזור התא. בקו תאי המעי הגס LS 180 ליצירת פרופיל מחזורי של קו תאי סרטן השד.

MC שבעה תאים נאספו כל שעה במשך שמונה שעות. לאחר הסרת הדופק BRDU. לאחר מכן מוינו התאים המסומנים במערכת החיסון ובכתמי ה-DNA על סמך האותות הפלואורסצנטיים שלהם.

כפי שניתן לראות כאן, שבעה תאי CF הסתובבו בקצב איטי משמעותית מכל אחד משני קווי תאי המעי הגס שנבדקו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד תיוג מטבולי של DNA בשילוב עם קציר נקודת זמן מאפשר לך לעקוב אחר קינטיקה של מחזור התא.