Summary
Wir stellen eine Methode zur Schaffung eines ausgedünnten Schädel kortikale Fenster (TSCW) in einem Mausmodell für
Abstract
Optische Kohärenztomographie (OCT) ist eine biomedizinische Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlichen Auflösung. Mit seiner minimal-invasive Ansatz Oktober wurde ausgiebig in der Augenheilkunde, Dermatologie und Gastroenterologie 1-3 verwendet. Mit einem ausgedünnten Schädel kortikale Fenster (TSCW) beschäftigen wir Spektral-Domain-OCT (SD-OCT) Modalität als ein Werkzeug zur Abbildung der Hirnrinde in vivo. Üblicherweise ein geöffneter-Schädel für bildgebende wurde verwendet, da es mehr Flexibilität bietet, jedoch eine weniger invasive TSCW Ansatz und ist ein wirksames Mittel für die langfristige Bildgebung in Neuropathologie Studien. Hier präsentieren wir eine Methode zum Erstellen einer TSCW in einem Mausmodell in vivo OCT-Bildgebung der Großhirnrinde.
Introduction
Seit seiner Einführung in den frühen 1990er Jahren Oktober wurde ausgiebig für biologische Bildgebung von Gewebe Struktur und Funktion 2 verwendet. Oktober erzeugt Querschnittsbilder durch Messen Echo Zeitverzögerung des rückgestreuten Lichts 4 durch Umsetzung mit geringer Kohärenz Lichtquelle mit einem faseroptischen Michelson Interferometer 2,4. SD-OCT, auch als Fourier Domain OCT (FD-OCT) bekannt ist, wurde zum ersten Mal in 1995 5 eingeführt und bietet eine überlegene Bildgebungsmodalität im Vergleich zu herkömmlichen Zeitbereich Oktober (TD-OCT). Im SD-OCT wird der Referenzarm stationär gehalten, was zu einer hohen Geschwindigkeit und ultrahoher Auflösung Bildaufnahme 6-9.
Derzeit haben TSCW Modelle weitgehend in vivo Bildgebung des Gehirns Anwendungen der Zwei-Photonen-Mikroskopie an Stelle eines traditionellen Kraniotomie verwendet. Diese TSCW wurden gleichzeitig mit einer benutzerdefinierten Schädel Platte oder einem Deckglas 10-13 verwendet, um zusätzliche ima bietenGing Stabilität. In unseren Studien haben wir festgestellt, dass Zubehör wie diese sind nicht für die OCT-Bildgebung erforderlich, wenn ein TSCW verwendet wird. Daher ermöglicht das Fehlen eines Schädels Platte oder Glasdeckgläschen für ein breiteres Spektrum von bildgebenden Fenstergröße, wie sie mit dem optischen Strahl interferieren können und verändern OCT-Bilder.
Eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung hat sich als in der Bildgebung des Gehirns mit Zwei-Photonen-Mikroskopie 10-13 vorteilhaft. In unseren Experimenten verwenden wir eine SD-OCT-Systems zur Abbildung der Hirnrinde in vivo durch einen TSCW. Unsere eigene SD-OCT-Bildgebung Setup enthält einen breitbandigen, geringer Kohärenz Lichtquelle aus zwei Superlumineszenzdioden (SLD) in 1295 nm mit einer Bandbreite von 97 nm, was zu einer axialen und lateralen Auflösung von 8 um und 20 um zentriert bzw. 14 . Mit unserem optischen Bildgebung Gerät, stellen wir uns, dass die Bildgebung durch eine TSCW großes Potenzial bei der Identifizierung und Visualisierung von Strukturen und Funktionen in der optically dichten Hirngewebe.
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Protocol
Ein. Chirurgische Vorbereitung
- Weibliche CD 1 Mäuse im Alter zwischen 6-8 Wochen wurden in unseren Experimenten verwendet.
- Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin einer Kombination (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg Xylazin). Platzieren Sie die Maus auf einer homöothermen pad die optimale Körpertemperatur bei ~ 37 ° C zu gewährleisten Kontinuierliche Überwachung von Betäubungsmitteln durch Testen Tieres Reflexe (z. B. Einklemmen Fuß mit stumpfen Pinzette) und injizieren mehr Betäubung, wenn nötig.
- Schmieren Sie beide Augen mit einem künstlichen Riss Salbe. Entfernen Sie Haare auf der Kopfhaut mit einer Rasierklinge und entfernen restliche Haar mit 70% Alkohol prep Pads. Tragen Sie eine dünne Schicht von Nair Enthaarungscreme auf der Kopfhaut und warten Sie 2 min für sie wirksam wird. Vorsichtig abwischen Nair und die restlichen Haare mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen und Alkohol prep Pads. Scalp sollte nun komplett haarlos.
- Desinfizieren der Kopfhaut mit einem betadine Tupfer-Stick und reinigen mit 70% Ethanol prep Pads.
- Vorsichtig wickeln Sie das Tier in Operationstüchern die optimale Körpertemperatur von ca. 37 ° C sicherzustellen und montieren das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen, um den Schädel zu immobilisieren. Tippen Sie auf den Schädel seiner Stabilität zu gewährleisten. Eine Liste der verwendeten Materialien sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
2. Verdünnt-skull Kortikale Fenster Vorbereitung
- Starten Sie den Einschnitt an der Mittellinie zwischen den Augen. Weiterhin kaudal zur Mittellinie zwischen den Ohren. Teil der Haut mit einer Pinzette.
- Suchen Sie den Bereich unter einem Binokular verdünnt und entfernen Sie vorsichtig die Blende mit einer Pinzette. Trocknen Sie die Schädel mit sterilen Wattestäbchen, bevor Sie die ausgedünnt kortikale Fenster. In unseren Experimenten haben wir eine 4 × 4 mm ausgedünnt kranialen Fensters ~ 1 mm posterior und lateral bregma.
- Beginnen Ausdünnung den Schädel mit einem runden Hartmetallfräser mit Bohrer 0,75 mm in einem chirurgischen Bohrmaschine mit Licht Kehrbewegung only. Wenden Sie keine direkten Druck auf den Schädel. Stoppen Bohren alle 20-30 Sek. Knochen Staub mit steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen zu entfernen und zu vermeiden Überhitzung des Schädels. Die Kochsalzlösung wird auch in Ableitung der Wärme über den Schädel zu unterstützen.
- Sobald die äußere Schicht des kompakten Knochen vollständig entfernt wird die mittlere Schicht Spongiosa sollte jetzt sichtbar. Es könnten leichten Blutungen wie Blutgefäße sind deutlicher in der Spongiosa Schicht. Wechseln Sie zu einem grünen Stein bur und weiter bohren mit besonderer Vorsicht die schwammigen Schicht ist feiner. Der grüne Stein bur löscht weniger Knochen während der Erstellung Ebenheit der gesamten kranialen Fenster. Stoppen Bohren gelegentlich Knochenmehl zu entfernen und den Schädel zu kühlen.
- Schließlich ist, wenn der Schädel ist transparenter geworden und Gefäßen am Gehirn jetzt sichtbar, beginnen Polieren des Schädels mit einem Polier-bur. Dies ermöglicht eine genauere Ausdünnung während Glätten den Schädel. Überprüfen Dünne des skull durch leichtes Antippen mit einer Pinzette. Stoppen Polierens, wenn der Schädel wird etwas flexibel.
- Der verdünnte kranialen Fenster sollte nun völlig glatt und reflektierend und bereit zum Abbilden (Abbildung 1). Aufgrund der Art der hoch streuenden Gewebe des Gehirns sollte der Schädel auf mindestens 55 um für die optimale Eindringtiefe verdünnbar. Eine Liste der verwendeten Materialien sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
3. Optical Coherence Tomography Imaging
- Nach der Operation abgeschlossen ist, überprüfen Tieres Atemfrequenz und Reflexe auf ein angemessenes Niveau der Anästhesie sicherzustellen und zu verwalten zusätzliche Betäubung, wenn nötig. Entfernen Tier aus der stereotaktischen Rahmen halten Tier-OP-Abdeckungen gewickelt und Transport Tier zum Imaging-Station.
- Vor Bildgebung überprüfen Zeichen für Reflexe und gelten zusätzliche künstliche Tränenflüssigkeit, wenn nötig. Montieren Tier auf den stereotaktischen Rahmen, um den Schädel zu sichern.
- Platz Tier unterOktober Kamera und positionieren Sie den TSCW unter dem optischen Strahl (Abbildung 2). Eine Querschnittsansicht des Schädels und Gehirn kann nun visualisiert werden (Abbildung 3).
- Die Datenerfassung kann beginnen, sobald Bereich des Interesses befindet. Zum Abbilden Zwecke, verwenden wir Galvo Spiegeln, eine Abbildungsanordnung Fenster mit einer Breite von 4,0 mm zu erreichen. Ein bildgebendes Tiefe von 2 mm wurde mit 6 mW des einfallenden Leistung und einem Brennpunkt 1 mm unterhalb des ausgedünnten Schädels erhalten. Jeder Querschnittsfläche bestand aus 2.048 axiale Scans mit einer Erfassungsrate von 0,14 Sekunden pro Bild.
- Volumetrischen Abtastungen des Gehirns kann auch durch Sammeln einer Serie von 2D-Querschnittbild-Bilder unter Verwendung von zwei Sätzen von Galvo Spiegel für xy Abtasten mit dem ersten Spiegel Galvo Abtasten des Strahls in der sagittalen Richtung und der zweiten Spiegel Galvo Abtasten in der koronalen erhalten werden Richtung.
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Representative Results
Nach dem Erstellen eines ausgedünnten Fenster über der Großhirnrinde das Gefäßsystem sollte nun optisch prominente (Abbildung 1) und wird für einen tieferen Bildtiefe ermöglichen (bis zu 1 mm). Die rechten Cortex wird auf ungefähr 55 um ausgedünnt zu einer normalen Schädels an 140 um (Abbildung 1) gemessen und stellt eine größere optische Klarheit verglichen. Weitere Verdünnung auf 10-15 &mgr; m ist möglich 11 jedoch nicht notwendig, da die Verwendung von Glas Deckgläser und Schädel Platten nicht in unseren Experimenten umgesetzt (Abbildung 1 und 2). Diese besondere Methode hat uns erlaubt, spezifische Strukturen (Großhirnrinde, corpus callosum) in unserem Oktober Schnittbilder (Abbildung 3) zu identifizieren. Parasagittalen OCT-Bilder eines normalen Schädels (3A) im Vergleich zu einem ausgedünnten Schädel (3B) gezeigt, um das Ergebnis eines OCT-Bild mit einer erfolgreichen TSCW vergleichen. Zusätzlich wird ein koronalen Querschnitt OktoberBild wird auch erhalten, um bei der Ermittlung Mittellinienstrukturen (3C) zu erleichtern. Die maximale Signalintensität für Abbildung 3 ist 45 dB über dem Grundrauschen. Ein Intensitätsprofil Vergleich eines nicht ausgedünnt Schädel und einem ausgedünnten Schädels offenbart eine größere Signalintensität und Eindringtiefe in einem TSCW Modell (Abbildung 4).
Abbildung 1. TSCW in einem Mausmodell. A 4 × 4 mm ausgedünnt Schädel-Fenster (bezeichnet in der gepunkteten quadratischen Box) ~ 1 mm posterior und lateral bregma erstellt über die rechte Gehirnhälfte mit verschiedenen zahnärztlichen Bohrern. Die rechten Cortex (verdünnt auf ca. 55 um) wesentlich transparenter als die nicht ausgedünnt Schädels (links Cortex, 140 um) eine größere Eindringtiefe für optische Bildgebung mittels Oktober β = Bregma, λ = lambda, SS = sagittNahtmaterial al.
Abbildung 2. OCT-Bildgebung des TSCW in vivo. Ein Mausmodell mit einer ausgedünnten Schädel ist in einem stereotaktischen Rahmen unter dem Ziel für OCT-Bildgebung in vivo fixiert.
Abbildung 3. OCT-Bilder der Hirnrinde in vivo. (A) parasagittalen OCT-Bild des Kortex unter einem normalen Schädel. (B) parasagittalen OCT-Bild des Kortex unter einem ausgedünnten Schädel. (C) Koronar OCT-Bild eines verdünnten Schädel (links) und einem normalen Schädel (rechts). Die Strukturen des Gehirns sind visuell unter einem scheinbaren TSCW zu einer normalen Schädels verglichen. OCT-Bilder aus wurden aus derselben Maus in vivo mit Abbildungsgröße 5 erhaltene0,5 mm × 2 mm mit einer maximalen Signalstärke von 45 dB. β = bregma, CC = Corpus callosum, SS = Pfeilnaht, Maßstab = 1 mm.
Abbildung 4. Intensitätsprofil Vergleich von normalen und ausgedünnt Schädel prep. TSCW ermöglicht erhöhte Signalintensität und Eindringtiefe. Die TSCW erreicht eine bildgebende Tiefe von etwa 1 mm mit hinreichender SNR.
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Discussion
Imaging mit OCT und einem ausgedünnten Schädel ist eine neuartige bildgebende Technik, die erst seit kurzem 15, 16 untersucht. In unseren Experimenten haben wir gezeigt, die Machbarkeit der SD-OCT-Bildgebung durch eine TSCW in einem Mausmodell in vivo. Aus unseren Ergebnissen wird der Schädel auf ca. 55 um verdünnt und die Eindringtiefe wird bei etwa 1 mm mit Bildauflösung von 8 um und 20 um in der axialen und lateralen Richtung erhalten wurden. In dem Signal-Intensitätsprofil, erhöht OCT-Bildgebung durch eine TSCW die Signalintensität und Eindringtiefe im Gegensatz zu einem normalen Schädel (Abbildung 4). Im Vergleich dazu können Zwei-Photonen-Bildgebung mit einem TSCW am Schädel Dicke von ~ 10-15 um Bildgebung Tiefen von 150-250 um unterhalb Pia-Oberfläche 10, 11, 13 gelangen mit axialen Auflösung bei ~ 3 um 10 während einer ausgedünnten Schädel ~ 20 um Bildtiefe kann bis zu 300-400 um innerhalb der Großhirnrinde 12. Overall, optische Bildgebung mit Oktober erweist sich als eine vielversprechende Modalität sein, erlaubt eine dickere TSCW während der Dünnungsprozess und gleichzeitig tieferen Eindringtiefe als mutiphoton Mikroskopie.
Verwenden eines ausgedünnten Schädel ist in der optischen Bildgebung wie Oct 15, 16 und Zweiphotonenmikroskopie 10-13 vorteilhaft, da es wenig bis gar keine Neuroinflammation bietet im Gegensatz zu einem Vergleich Kraniotomie wenn erfolgreich Ausdünnung 11, 12, 15, 16, durchgeführt wird. Verwendung eines Kraniotomie zum Abbilden kann in reaktiver Mikroglia sowie Hochregulation von glial fibrillary acidic protein (GFAP) in reaktiven Astrozyten nach Beleidigungen zum Gehirn führen. Allerdings offenbart Bildgebung nach Annahme eines ausgedünnten Schädel-Technik nicht aktiven Mikroglia und schwach GFAP Immunfärbung impliziert nicht-reaktiven Astrozyten 10. Durch geeignete Ausdünnung des Schädels, bestimmte Strukturen innerhalb der Großhirnrinde, wie Mikroglia Morphologie und kortikalen Gefäße, cein unterschieden 11-13 werden. Dennoch gibt es Nachteile bei der Verwendung eines TSCW für optische Bildgebung. Wenn der Schädel ist nicht auf die richtige Dicke ausgedünnt oder der Schädel hat raue Oberflächen, die durch unsachgemäße Ausdünnung Eindringtiefe für die Bildgebung kann begrenzt werden. Ein weiterer Nachteil für die armen Bildtiefe können von subduralen Blutungen aufgrund von Vibrationen der Bohrungen führen. Blutungen unter der Dura ist unvermeidbar und kann daher nicht für die OCT-Bildgebung verwendet werden. In diesen Fällen sollte ein neues Tiermodell für das Experiment verwendet werden.
Identifizierung bestimmter Strukturen innerhalb der Hirnrinde mit Oktober durch eine TSCW kann bei der Verfolgung neurodegenerativen Erkrankungen und bei der Untersuchung Veränderungen der Gehirnfunktion hilfreich. Imaging Blutfluss durch Doppler Okt 17, 18 erreicht werden, wie Quantifizieren Hirndurchblutung ist bei der Überwachung der metabolischen Anforderungen des Gehirns bei der Untersuchung Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit 18 oder 17 überragender Hirntumoren. Axonalund neuronale Degeneration ist auch im Oktober Bildern prominenter und Studien verschiedener Hirnerkrankungen profitieren. Durch die Abbildung der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL), die Ganglienzellen Axone, die Mechanismen der Neurodegeneration, Neuroprotektion und neuro-Reparatur enthält, kann nicht nur visualisiert werden in optischen Störungen, sondern auch bei neurologischen Erkrankungen wie Parkinson 19 und mehrere Sklerose 20, 21, wobei letztere die im Detail wurde durch Messen der Makula und Retina 21 Schichtdicke durch Oktober Segmentierungstechniken 20 untersucht.
Neuro-Bildgebung mit OCT ist nicht nur auf bildgebende Strukturen und Funktionen des Gehirns beschränkt. Oktober können in chronische vorteilhaft in vivo Bildgebung 10, 11 sowie in der stereotaktischen Verfahren wie elektrophysiologischen und Mikroinjektionsstudien 1, 3, 15-17. In der Neurochirurgie, können Oktober als Biopsie oder Führung Werkzeug 2, indem Chirurgen zu sehen verwendet werdenEchtzeit-Feedback Bilder bestimmter anatomischer Merkmale innerhalb des Gehirns 17. Mit Weiterentwicklungen, glauben wir, unsere aktuellen Kombination von SD-OCT mit einem TSCW hat das Potenzial, ein Arzt die Fähigkeit zur Diagnose neurologischer Defizite zu verbessern, wenn es mit anderen Modalitäten wie einer intrakraniellen Druck (ICP) Monitor 22, Kernspintomographie angewendet wird ( MRI) oder Computerized Axial Tomography (CAT) 1.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der UC Discovery-Proof of Concept Zuschuss und durch die NIH (R00 EB007241) unterstützt. Die Autoren möchte auch Jacqueline Hubbard für ihre Unterstützung danken, die in diesem Experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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