Summary
私達はのためのマウスモデルにおける間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を作成する方法を紹介
Abstract
光コヒーレンストモグラフィ（OCT）は、高時空間分解能で生物医学イメージング技術です。その低侵襲アプローチと10月は皮膚科、眼科、消化器1-3に広く使用されています。間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を使用して、我々は、in vivoでの画像の皮質をするためのツールとしてスペクトラルドメインOCT（SD-OCT）モダリティを採用しています。一般的に、それは、より汎用性を提供するように開かれ、頭蓋骨がニューロイメージングのために使用されてきた、しかし、TSCWアプローチは、低侵襲であり、神経病理学的研究における長期的イメージングのための効果的な平均である。ここでは、大脳皮質の in vivoイメージングの 10月のマウスモデルにおけるTSCWを作成する方法を紹介します。
Introduction
1990年代初頭の登場以来、10月は、組織の構造と機能2の生体イメージングのために広く使用されてきました。 10月は、光ファイバ·マイケルソン干渉計2,4低コヒーレンス光源を実装することにより、後方散乱光4のエコー遅延時間を測定することにより、断面画像を生成します。また、フーリエドメインOCT（FD-OCT）として知られている、SD-OCTは、1995年に初めて5年に導入され、従来のタイムドメインOCT（TD-OCT）と比較して優れた画像診断法を提供しています。 SD-OCTでは、参照アームが高速·超高解像度の画像取得6-9で得られた静止状態に保たれています。
現在、TSCWモデルは従来の開頭術の代わりに、2光子顕微鏡の in vivoでの脳の画像アプリケーションでのために主に使用されている。これらTSCWは追加IMAを提供するために、カスタム頭蓋骨板またはガラスカバースリップ10月13日と同時に使用されてきた安定性を変更する。我々の研究では、TSCWが使用されている場合これらのような付属品はOCTイメージングのために必要ではないことを観察した。彼らは光ビームと干渉し、OCT画像を変更することがありますしたがって、頭蓋骨板またはガラスカバースリップの欠如は、イメージング·ウィンドウサイズの広い範囲を可能にします。
間引き頭蓋骨の準備は、二光子顕微鏡10-13を用いて脳のイメージング研究に有利で あることが判明した。私たちの実験では、TSCWを通じて体内画像皮質に、SD-OCTシステムを利用しています。当社のカスタムSD-OCTイメージングセットアップは、それぞれ8μmと20μmの軸方向および横方向の解像度が得97 nmの帯域幅で1295 nmの中心とする2つのスーパールミネッセントダイオード（SLD）14からなる広帯域、低コヒーレンス光源が含まれています。弊社の光学撮像素子では、我々はTSCW介して撮像がoで構造と機能を特定し、可視化に大きな可能性を持っていることを想像するptically密脳組織。
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Protocol
1。手術の準備
- 6-8週間の年齢の間に雌性CD-1マウスは、私たちの実験で使用した。
- ケタミンおよびキシラジンの組み合わせ（80 mg / kgのketamine/10 mg / kgをキシラジン）の腹腔内注射でマウスを麻酔。 〜37℃で最適な体温を確保するための恒温パッドの上にマウスを置き継続的に動物の反射を（ 例えば 、鉗子で鈍足をつまんで）テストすることによって、麻酔のレベルを監視し、必要に応じてそれ以上の麻酔を注入します。
- 人工涙液軟膏で両眼を潤滑します。カミソリを使って頭皮に毛を削除し、70％アルコールの準備パッドを用いて残留毛を取り除く。頭皮上Nairさんの脱毛クリームの薄い層を適用し、それを有効にするには、2分間待ちます。穏やかに生理食塩水を使用してNairさん、残りの髪は綿棒とアルコールの準備パッドを湿らせ拭き取ってください。頭皮は完全に無毛である必要があります。
- ベタジンスワブスティックを使用して頭皮を消毒すると7をクリーン0％エタノール準備パッド。
- 〜37の最適な体温を確保するための手術用ドレープで動物を注意深く包む℃、頭蓋骨を固定する定位フレームに動物をマウントします。軽くて安定性を確保するために頭蓋骨をタップします。使用される材料のリストを表1に提供されています。
2。間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ準備
- 目の間の正中線の時点で切開を開始します。耳の間の正中線点まで尾を続行します。鉗子との部分は皮膚。
- 解剖顕微鏡下で薄くする領域を見つけ、ゆっくりとピンセットを用いて筋膜を除去します。間伐皮質のウィンドウを作成する前に、滅菌綿棒で頭蓋骨を乾かします。私たちの実験では、4×4mmの間伐頭蓋窓〜後部とブレグマ横1ミリメートルを作成しました。
- 光抜本的な動きのONLを使用して外科ハンドドリルにドリルビットサイズ0.75ミリメートルの丸カーバイドバーを用いて頭蓋骨を薄く開始yである。頭蓋骨の上に直接圧力をかけないでください。滅菌生理食塩水と綿棒を用いて骨ほこりを取り除くために、頭蓋骨の過熱を防ぐため、毎年20〜30秒の掘削を停止します。生理食塩水はまた、頭蓋骨全体に熱を放散させるのに役立ちます。
- 緻密骨の外側の層が完全に除去されたら真ん中の海綿骨の層が表示されるようにする必要があります。血管が海綿骨層でより明らかになりますようにいくつかのわずかな出血があるかもしれません。緑石のいがに切り替えて、海綿層がより繊細であるため特別な注意を用いた掘削を続ける。頭蓋窓全体に均一の作成中に緑色の石のいがが少ない骨材を除去します。骨塵を除去し、頭蓋骨を冷却するために時折ドリルを停止します。
- 最後に、頭蓋骨の透明性と脳への血管系になったときに表示されるようになりました、研磨バールを使って頭蓋骨を研磨開始。頭蓋骨を下にスムージングしつつ、間伐より正確にできるようになります。 SKUの薄さをチェック静かにピンセットでそれをタップして、LL。頭蓋骨が少し柔軟になったときに研磨を停止します。
- 間伐頭蓋窓は完全に滑らかで反射およびイメージング（ 図1）のために準備ができているはずです。非常に脳の組織の散乱の性質上、頭蓋骨は、最適な深さの浸透のために少なくとも55ミクロンまで薄くする必要があります。使用される材料のリストを表1に提供されています。
3。光コヒーレンストモグラフィーイメージング
- 手術が完了した後、麻酔の適切な水準を確保し、必要に応じて追加の麻酔を投与する動物の呼吸速度と反射神経をチェックします。 、定位フレームから動物を削除する手術用ドレープに包まれた動物を維持し、イメージングステーションに動物を輸送する。
- イメージングは、反射の標識を確認し、必要に応じて追加の人工涙液を適用する前に。頭蓋骨を確保するための定位フレームに代わって動物をマウントします。
- 下に動物を置き10月のカメラと位置光ビーム（ 図2）に基づくTSCW。頭蓋骨と脳の断面図になりました（ 図3）可視化することができる。
- 関心領域が配置された後、データ取得を開始することができます。イメージング目的のために、私たちは4.0ミリメートルの幅で撮像窓を達成するためにガルボミラーを使用しています。 2mmの撮像深度は6入射電力は、mWと焦点間伐頭蓋骨1mm以下で得られた。それぞれの断面積は、画像1枚あたり0.14秒の取得率は2048軸方向走査で構成されていた。
- 脳の体積スキャンも、xyはサジタル方向にビームを走査する第一ガルバノミラーとコロナでスキャン第二ガルバノミラーで走査するためのガルバノミラーの2セットを使用して2D断面一連の画像を収集することによって得ることができる方向。
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Representative Results
大脳皮質上間伐ウィンドウを作成した後血管系は、より視覚的に顕著でなければなりません（ 図1）と深い撮像深度（1mmまで）が可能になります。右皮質は140μmで（ 図1）で測定した正常な頭蓋骨に比べ、より大きな光学的透明度を提供するので、約55ミクロンまで薄くされる。さらに10から15μmまで薄くするガラスカバースリップと頭蓋骨プレートの使用など、しかし必要ではないが（ 図1および2）我々の実験では実装されていない11が可能です。この特定の方法は、我々の10月断面画像（ 図3）で特定の構造（大脳皮質、脳梁）を識別することができました。間伐頭蓋骨（ 図3B）と正常頭蓋骨の矢状OCT画像（ 図3A）が成功したTSCWとOCT画像の結果を比較するために示されています。さらに、冠状断面10月画像はまた正中線構造（ 図3C）を識別するのに容易にするために取得されます。 図3の最大信号強度がノイズ·フロアより45デシベルです。非間伐や間伐頭蓋骨頭蓋骨の強度プロファイルの比較TSCWモデル（ 図4）の大きい信号強度と深さの浸透を明らかにする。
図1。 TSCWマウスモデルインチ A 4×4mmの間伐頭蓋骨ウィンドウ（点線の四角のボックスに示されている）種々の歯科BURSを使用して、右大脳半球の上ブレグマに後方と横約1mmに作成されます。右皮質（約55ミクロンまで薄く）OCTを用いた光イメージングのための大きい深さの浸透を提供する非間伐頭蓋骨（左大脳皮質、140μm）よりもはるかに透明である。 β=ブレグマ、λ=λ、SS = sagittアル縫合。
図2。 in vivoでの TSCWのOCT画像。間引き頭骨を搭載するマウスモデルは、 生体内 OCTイメージングのための客観的な下定位フレームに固定されています。
図3。 in vivoでの大脳皮質のOCT画像。通常頭蓋骨下皮質の（A）の矢OCT画像。間伐頭蓋骨下皮質の（B）の矢OCT画像。間伐頭蓋骨（左）と通常の頭蓋骨（右）（C）のコロナOCT画像。通常の頭蓋骨と比較して、脳の構造がTSCW下でより視覚的に明らかである。からOCT画像は撮像サイズ5を用いた in vivo で同じマウスから得られた0.5ミリメートル×45 dBの最大信号強度を持つ2ミリメートル。 β=ブレグマ、CC =脳梁は、SS =矢状縫合、スケールバー= 1ミリメートル。
図4。通常、間伐頭蓋骨準備。TSCWの強度プロファイルの比較が増加し、信号強度と深さの浸透を可能にします。 TSCWは十分なSNRが約1mmの撮像深度を実現しています。
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Discussion
10月と間引き頭蓋骨によるイメージングはごく最近検討されている小説のニューロイメージング技術15、16です。私たちの実験では、in vivoでのマウスモデルにおけるTSCWを通して、SD-OCTイメージングの実現可能性を実証した。我々の結果から、頭蓋骨が約55μmまで薄くされると侵入深さは、それぞれ、軸方向および横方向に8μmと20μmの画像解像度で約1ミリメートルで得られる。通常の頭蓋骨（ 図4）と比較して信号強度プロファイルでは、TSCWを通してOCTイメージングは、信号強度と深さの浸透を高めます。 〜10月15日程度が3μm〜10の間伐頭蓋骨ながら〜で軸分解能で軟膜表面下150から250μmの10、11、13の撮像深さに達することができるの頭蓋骨の厚さでTSCWとの比較では、2光子イメージング20μmの撮像深度は、大脳皮質12内に300から400μmにまで達することができる。 OVerall、10月と光イメージングはmutiphoton顕微鏡よりも深く浸透深さを提供しながら、薄化プロセスの間に厚いTSCWを可能にして、有望なイメージングモダリティであることが分かる。
間伐が正常に11、12、15、16、実施されている場合は開頭術に比べて、それがない神経炎症に少しを提供するように間引き頭蓋骨を活用することなど10月15日、16と2光子顕微鏡10月13日のような光学イメージングに有利で ある。イメージングのための開頭術を採用することで、反応性ミクログリアと同様に、脳への侮辱後の反応性アストログリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のアップレギュレーションをもたらすかもしれません。しかし、間引き頭蓋骨技術を採用した後の画像では、非アクティブなミクログリアと10の非反応性アストロサイトを暗示弱いのGFAP免疫染色を明らかにする。そのようなミクログリアの形態と皮質血管系、cと大脳皮質内の頭蓋骨の適切な間伐、特定の構造、スルー11月13日に区別することができます。それにもかかわらず、光学的イメージングのためにTSCWを使用することの欠点があります。頭蓋骨が正しい厚さに薄くまたは頭蓋骨がイメージングのための不適切な間伐深浸透による粗面を持っていない場合は制限される場合があります。貧しい撮像深度ためのもう一つの欠点は、掘削の振動に起因する副硬膜出血に起因するかもしれない。硬膜下出血は避けられないため、OCTイメージングに使用することはできません。このような場合には、新たな動物モデルは、実験に使用されるべきである。
TSCWを通してOCTを用いて皮質内の特定の構造を同定することは、神経変性疾患を追跡したり、脳の機能の変化を研究する際に役立つことができます。イメージング血流は脳血流量はストロークを勉強中の脳、アルツハイマー病18、または脳腫瘍の17の代謝要求を監視するのに最重要である定量としてドップラーOCT 17、18を介して達成することができる。軸索のと神経変性もOCT画像で顕著であり、様々な脳疾患の研究を受けることができます。イメージングによる神経節細胞の軸索、神経変性の機序、神経保護、神経の修復が含まれている網膜神経線維層（RNFL）は、光学的疾患においても、パーキンソン19および複数の神経学的疾患だけでなく可視化することができる多発性硬化症20、21、10月20日のセグメンテーション技術によって黄斑部21と網膜の層の厚さを測定することによって詳細に検討されている後者。
10月と神経イメージングは、イメージングの構造や脳の機能に限定されません。 10月は 、in vivoイメージング10、11 で 、ならびにそのような電気生理学的およびマイクロインジェクション研究1、3、15-17として定位手続における慢性的に有利で あることができる。脳神経外科では、10月には外科医が表示できるようにすることで、生検またはガイディングツール2として使用することができます17脳内の特定の解剖学的特徴のリアルタイムのフィードバックイメージ。さらなる発展に伴い、我々はそれがそのような頭蓋内圧（ICP）モニター22、磁気共鳴画像（他のモダリティに印加されたときにTSCWのSD-OCTの当社の現在の組み合わせが診断神経学的欠損をする臨床医の能力を向上させる可能性を秘めていると信じてMRI）やコンピュータ体軸断層撮影（CAT）1。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、コンセプト助成のUCディスカバリープルーフによっておよびNIH（R00 EB007241）によってサポートされていました。著者らはまた、この実験では彼女の援助のためのジャクリーン·ハバードに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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