Summary
myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 그의 표현 다른 이미징 modalities를 이미징 할 수 있습니다 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자의 장점을 걸립니다. 여기, 우리는 사용을
Abstract
Duchenne 근육질 영양 장애 (DMD)는 3500 소년의 1에 영향을 미치는 심각한 유전 신경 근육 장애이며, 진보적 인 근육 퇴행 1, 2에 의해 특징입니다. 환자에서 손상된 myofibers를 다시 생성 할 수 주민 근육 위성 세포의 능력 (SCS)는 4 점점 비효율적이된다. 따라서, 건강 분야에서 근육 전구 세포 (MPCs) / myoblasts의 이식은 DMD에 유망한 치료 방법이다. 줄기 세포 치료의 사용에 대한 주요 제한은, 그러나, 이식 세포의 장기 모니터링을위한, 그 효과를 평가하기위한 신뢰할 수있는 이미징 기술의 부족이다. 여기, 우리는 myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적, 실시간 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 (반딧불 루시 페라 [fluc], monomeric 붉은 색 형광 단백질 [mrfp]와 sr39 thymidine의 키나제 [sr39tk]) expre 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자 활용ssion은 여러 이미징 modalities 9, 10으로 이미징 할 수 있습니다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 계산 된 단층 촬영 (SPECT), 자기 공명 영상 (MRI), 광학 이미징, 높은 주파수 3D-초음파 등의 영상 modalities의 다양한 고유의 장점과 한계를 각각, 지금 사용할 수 있습니다 11. Bioluminescence 이미징 (BLI) 연구 예를 들어, 상대적으로 낮은 비용과 높은 처리량가되는 장점이 있습니다. 그것은이 연구에서, 우리는 마우스에 주입 후 가능한 C2C12 myoblasts의 단기 현지화를위한 융합 유전자 및 bioluminescence 이미징 (BLI) 내에 포함 된 반딧불 루시 페라 제 (fluc) 리포터 유전자 시퀀스를 이용, 이런 이유로 DMD의 모델 12-14 (X 염색체 [MDX] 마우스에 근육 영양 장애). 중요한 것은, BLI라는 MPCs 후 주입의 동력학을 검토 할 수있는 수단으로 우리를 제공하며, t를 통해 반복적으로 세포를 추적 할 도움이 될 것입니다IME와 다음과 같은 마이그레이션. 우리 리포터 유전자 접근 방식이 더 우리는 하나의 생활 주제에 여러 이미징 modalities를 병합 할 수 있습니다, 단층 자연, 훌륭한 공간 해상도와 큰 동물과 인간 10,11까지 확장 할 수있는 능력에 따라, PET 미래 작업의 기초를 형성 할 우리 제안은 잠복기 모델 및 임상 응용 프로그램에 세포 개발 방법의 급속한 번역을 촉진 할 수 있습니다.
Protocol
1. C2C12 Myoblasts의 유지 관리 및 전파
- 판 C2C12 75cm 2 플라스크에 myoblasts와 10 %의 최종 농도에 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 높은 포도당 Dulbecco의 수정 된 이글의 세럼 (HG-DMEM)에 세포를 유지하고 있습니다. 이 myoblastic 인구를 고갈되므로 세포는 언제든지 합류가하는 것을 허용하지 않습니다. ° C 사용하기 전에 물을 욕조에 37 항상 따뜻한 매체 :. 매체는 매일 참고 변경해야합니다.
- myoblasts이 약 80 % 합류가되면 새로운 플라스크에 통과 세포. 문화 매체를 대기음. 트립신 억제 혈청을 포함 문화 매체의 모든 흔적을 제거하는 4-5 ML 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)으로 세포를 씻으십시오. 간단히 2-3 ML 0.25 % 술병에서 자기편 myoblasts을 해리하는 (w / V) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션과 세포 레이어를 씻어. 5 분에 37 ° C에서 보육의 트립신과 장소 플라스크를 대기음.
- 이 incuba 동안기는 HG-DMEM/10 % FBS 매체의 구 ML로 새 플라스크를 준비합니다. trypsinization 후, 중간에있는 모든 세포의 수집을 보장하기 위해 셀 및 피펫 4-5 시간에 완벽한 매체 10 ML를 추가합니다. 새로운 플라스크에 세포 현탁액 1 ML을 추가하고 37 5 % CO 2에 품다 ° C.
2. C2C12 세포 Transfection
- 일단 세포는 Invitrogen에서 제조업체의 지침에 따라, confluency 50 %를 transfect에 도달했습니다. 간단히, 4.5 ML OPTI-가상 매체와 90 μl Lipofectamine 2000 시약 조화를 이루고 있습니다. 또 다른 관에서 4.5 ML OPTI-가상으로 36 μg CMV-trifusion 기자 유전자 DNA가 조화를 이루고 있습니다. 5 분을 결합하고 기다리는 각 관을 긋기. 두 튜브의 내용을 결합하여, 부드럽게 혼합 정확히 삼십분 동안 실온에서 배양 참고 :. 두 번째 플라스크는 단지 부정적인 제어 역할을 Lipofectamine 및 OPTI-가상을받을 수 untransfected 셀에 설정해야합니다.
- C2C12 세포에서 미디어를 제거하고 15.5을 추가신선한 HG-DMEM/10 % FBS 매체의 ML. 20 ML에 총 볼륨을 가져 transfection 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 세포가 37 최소한 20 시간을 위해 밤새 transfect 할 수 있도록 허용 ° C.
- 다음 날, transfection 매체를 대기음 10 ML HG-DMEM/10 % FBS를 추가합니다.
- 역 형광 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. 시야과 붉은 형광 이미지를 모두 캡처 (TRITC 필터 큐브를 이용하여, mrfp 예 / EM : 607분의 584 nm의). transfection 효율을 생성하는 뷰의 여러 분야에 대한 시야에서 볼 셀의 총 횟수로 나눈 형광에서 볼 RFP - 표현 세포의 수를 계산합니다.
3. 셀 Survivability / MTT 분석의 평가
- 24 잘 플레이트의 각도에 transfection, 판 1x10 5 C2C12 세포하기 전에 어느 날. 셀은 HG-DMEM/10 % FBS 500 μl 권 도금해야합니다.
- 다음 날, transfect의 myoblasts 하룻밤 이전에 설명 된대로. transfection 시약에 대한 제조업체의 제안에 따라24 잘 접시 t 권. 컨트롤에 불과 Lipofectamine (NO DNA)와 우물 세트를 품다. 그 적절한 transfection가 발생했습니다 보장하기 위해 형광에 따라 세포를 볼 수 있습니다.
- HG-DMEM/10 % FBS 5 MG / ML thiazolyl 블루 tetrazolium 브로마이드 (MTT)에 transfection 매체 및 품다 myoblasts을 제거합니다. transfected 우물의 8 D-luciferin을 추가, 4 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 우물에서 매체를 제거합니다. 각도에 이소프로판올 180 μl를 추가하여 파란색 formazan의 결정을 Solubilize. 15 분에 37 ° C에서 흔들어.
- 96 - 웰 플레이트에있는 침전물, 피펫 솔루션을 피하고 575 nm의에서 흡광도를 참조하십시오.
4. 이식을위한 Myoblasts의 작성
- , 미디어를 제거 HBSS와 myoblasts을 씻고, 및 1.1에 명시된 바와 같이 셀을 trypsinize.
- 전체 매체 중 4 ML의 세포를 다시 일시 중지합니다.
- hemocytometer 사용 10 6 myoblasts를 포함하는 볼륨을 생성하기 위해 셀을 계산합니다. 피펫 권멸균 1.5 ML의 microtubes에 매화. ~ 10 %의 transfection 효율이 값은 100,000 루시 페라 제 - 표현 세포가 이식 후 GE ExploreOptix 스캐너에서 감지되고있는 것으로 나타났습니다.
- 10 6 C2C12 세포를 포함, 15 μl의 최종 주입 볼륨을 충족해야합니다. 필요한 경우, 1 분에 2,000 rpm으로 microtubes을 원심 분리기. 피펫으로 표면에 뜨는을 자세히 대기음. HG-DMEM는 FBS를 부족의 15 μl로 세포를 다시 일시 중지합니다.
5. 세포 주입
- 2퍼센트 2 / isoflurane % O 2 마우스를 마취. 등쪽의 뒷다리 영역에서 머리카락을 따. 1.5 % 2 / isoflurane % O 2 마취를 유지합니다.
- 확인 C2C12 myoblasts도 일시 중지됩니다. 쉬운 위치에 마우스로, 뒷다리 다리를 확장하고 직접 30 ° 각도에서 gastrocnemius 근육의 외측 머리에 세포를 주입하는 인슐린 주사기를 사용합니다. 오른쪽 뒷다리와 untransfected myoblasts의 정수로 transfected myoblasts를 삽입contralateral (왼쪽) 뒷다리 다리를 O.
- 기준 bioluminescence 검사를 수행 빠르게 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓고, 광학 스캐너에 무대에 마우스를 전송할 수 있습니다. 마취 줄을 연결. 마우스가 anesthetized 상태로 유지하려면, 두 사람이 마취 라인을 연결하기 위해 존재해야합니다 스캐너의 다른 장소 동물 동안.
- 분사의 영역이 표시되도록 부드럽게 뒷다리 다리를 확장합니다. 예를 들어, 의료 테이프와 같은 부드러운 접착제와 장소에 테이프를 두 다리.
- 챔버를 닫고이 감지 배경 신호를 증가로 더 빛이, 스캐너의 내부에 액세스 할 수 없습니다 있는지 확인합니다. 스캐너는 bioluminescence 이미징에 대한 제조업체의 지침에 포함 된 매개 변수를 설정해야합니다. 특히, "더 이상 레이저"를 선택하지 않습니다 보장합니다.
- 뽑혀 지역 및 시작 검사 주변 관심 (ROI)의 영역을 그립니다.
6. MDX 마우스로 Fluc 기판, D-luciferin의 주입
<좋았어요>7. BLI는 DMD의 마우스 모델에 임플란트 후 루크 - 표현 MPCs를 타겟팅 할 수
- 5.1에서 설명 된대로 이해 기간 후, 다시 마우스를 마취.
- 광학 스캐너에 다시 마우스를 전송하고 백그라운드 검색과 같은 방식으로 다른 bioluminescence 검색을 수행합니다.
- 20 분 통풍 관 기간이 최대 신호 강도를 제공해야하지만, 이후의 스캔이 수행 될 수 있습니다.
- 이미지 수집이 완료되면, 당신의 기관 동물 윤리위원회 및 동물 관리 (CCAC)의 캐나다 협의회가 설정 한 지침에 따라 마우스를 희생. 내가 바로 뒷다리의 근육과 장소를 분리N 포르말린 10 % 파라핀 근입을 수정합니다. myoblasts의 근육 주사를 확인하는 루시 페라 제에 대한 immunohistochemistry 착색을 수행합니다.
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Representative Results
50~60% confluency시, C2C12 myoblasts는 transiently 위에서 언급 한 퓨전 기자 유전자가 반딧불 루시 페라로 구성된 구조와 transfected되었습니다 [fluc], monomeric 붉은 색 형광 단백질 [mrfp]와 sr39 thymidine 키나제 [sr39tk] (그림 1A). Transfection 효율은 건설 기자의 mrfp 시퀀스의 활용, 형광 현미경 (인물 1B, C)을 통해 계산되었다. 셀 survivability은 BLI 기판, D-luciferin (그림 1D)과 라벨에 의해 영향을받지 않는다되었다. transfection 후, 약 100,000 mrfp - 표현 myoblasts는 MDX 마우스의 gastrocnemius 근육 (이전에 원고를 제출 결정)에 intramuscularly 이식 된, 100,000 untransfected 세포가 유사하게 컨트롤로 contralateral 뒷다리로 이식되었다. 바로 다음 셀 주입은 쥐들이 주입 된 150 밀리그램 / kg D-lucife과 intraperitoneally (IP)린. ~의 이해 기간에 따라 20 분은, 마우스는 작은 동물 광학 스캐너 (라이브 동물 bioluminescence과 형광에 구비되어 있습니다 GE ExplorOptix 블랙 박스)에 이미징되었습니다. 이전에 체외 및 사후 주입 (원고 제출) D-luciferin의 이해에 모두 시연으로 untransfected 셀에 없음 감지 bioluminescence (그림 2)과 함께 fluc - 표현 myoblasts에 해당했다. Immunohistochemistry는 myoblasts의 근육 이식 (그림 3) 확인
그림 1 CMV-trifusion 기자 구조 (A)의 도식,. brightfield / 플라스미드 trifusion 기자 (B, C)로 transfected C2C12 myoblasts의 형광 이미지, BLI 기판, D-루시퍼와 라벨에 따라 C2C12 세포 survivability을 평가하는 MTT 분석 의 (D).
그림 2. Bioluminescence 이미징 (BLI)가. 관심 (ROI)의 지역은 myoblasts은 (A) 주입하는 뽑혀 뒷다리 영역을 둘러싸 그려집니다. Bioluminescence은 백그라운드 검색 (B) 동안 발견되지 않습니다. D-luciferin 주입 후 23 분에서 명확한 신호는 루시 페라 제 - 표현 myoblasts가 주입되는 뒷다리 갈기 검출된다. 더 bioluminescence가 untransfected myoblasts (C)와 함께 주입 contralateral 뒷다리에 감지되지는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 3. 반딧불의 루시 페라 항체를 사용하여 IHC는 transfected C2C12 세포의 근육 주입을 확인합니다.
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Discussion
본 연구에서는, 우리는 이식 후 비 invasively 대상 myoblasts / MPCs에 신속하고 신뢰할 수있는 분자 영상, 리포터 유전자의 접근 방식을 설명하고 있습니다. 이 연구는 bioluminescense 이미징 (BLI), 사실은, 쉽게 세포의 주입을 통해 세포 engraftment의 길이 방향 평가에 적용 할 수있는 세포를 타겟으로하는 방식을 통해 이식 MPCs의 단기 현지화을 보여줍니다 동안 안정적으로 명시 리포터 유전자. 이를 위해, 우리 그룹은 통일 리포터 유전자를 가지고 있고, 유전자 변형 마우스 라인을 생성하고 있습니다. 리포터 유전자를 표현 만 셀 BLI를 사용하여 시각화를 위해 광자를 생성하기 위해 D-luciferin을 산화. D-luciferin의 산화는 유전자 발현에 의존하기 때문에,이 비 invasively 이미지를 가능한 이식 세포에있는 강력한 기술입니다. FACS를 통해 격리 이러한 유전자 변형 마우스 및 위성 세포 (SCS)에서 수확 근육 조직은 실제로 targete 할 수 있습니다d는 MDX 마우스에 주입에 따라. 또한, 우리는 더 DMD 연구 분야 (원고 제출)로, 여기에서 제시 등, 분자 이미징 기술의 유용성과 중요성을 고조, 근육 특정 발기인의 사용을 통해 차별화 상태를 추적 할 수 있습니다. 의 급속하고 저렴한 비용뿐만 아니라, BLI는 작은 동물의 자주 이미징을위한 매력적인 선택이, 무독성입니다. 이 기능은,뿐만 아니라 높은 특이성으로, 이러한 PET 등의 기술을 포함하는 임상 - 관련 연구에 발전하기 전에 Duchenne 근육질 영양 장애의 사전 임상 질병 모델에 myoblast 교체 요법을 수정에 매우 귀중합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 수 없어요.
Acknowledgments
저자는 fluc/mrfp/sr39tk의 리포터 유전자의 선물 Sanjiv Gambhir 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 줄기 세포 네트워크 (SCN), 그리고 제시의 여행 재단의 지원을받는되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
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