Summary
En ikke-invasiv måte å vurdere effekten av myoblast transplantasjon er beskrevet. Metoden benytter seg av det enhetlig fusion rapportørgen sammensatt av gener hvis ekspresjon kan avbildes med forskjellige imaging modaliteter. Her benytter vi en
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en alvorlig genetisk nevromuskulær lidelse som rammer 1 av 3500 gutter, og er preget av progressiv muskel degenerasjon 1, 2. Hos pasienter, blir evnen til bosatt muskel satellitt celler (SC) for å regenerere ødelagte myofibers stadig ineffektiv 4. Derfor er transplantasjon av muskel stamceller (MPCs) / myoblasts fra friske forsøkspersoner en lovende terapeutisk tilnærming til DMD. En viktig begrensning for bruken av stamcelleterapi, derimot, er en mangel på pålitelige bildebehandlingsteknologier for langsiktig overvåking av implanterte celler, og for å vurdere effektiviteten. Her beskriver vi en ikke-invasiv, real-time tilnærming for å vurdere effekten av myoblast transplantasjon. Denne metoden tar fordel av en enhetlig fusion reporter genet består av gener (firefly luciferase [svingninger], monomere rød fluorescerende protein [mrfp] og sr39 tymidinkinase [sr39tk]) hvis expression kan avbildes med forskjellige bildediagnostikk 9, 10. En rekke bildediagnostikk, inkludert positronemisjonstomografi (PET), single-foton emisjon computertomografi (SPECT), magnetisk resonans imaging (MRI), optisk bildebehandling og høy frekvens 3D-ultralyd er nå tilgjengelig, hver med unike fordeler og begrensninger 11. Bioluminescens imaging (BLI) studier, for eksempel, har den fordelen av å være relativt lav kostnad og høy gjennomstrømning. Det er av denne grunn at i denne studien, gjør vi bruk av firefly luciferase (svingninger) reporter gensekvensen inneholdt i fusion genet og Bioluminescens imaging (BLI) for den kortsiktige lokalisering av levedyktige C2C12 myoblasts etter utsetting i en mus modell av DMD (muskeldystrofi på X-kromosomet [MDX] mus) 12-14. Viktigst, gir BLI oss med et middel for å undersøke kinetikken av merket MPCs etter implantasjon, og vil være nyttig for å spore celler gjentatte ganger over time og følgende migrasjon. Vår reporter genet tilnærming videre tillater oss å slå sammen flere bildediagnostikk i en enkelt levende faget, gitt tomographic natur, fine romlig oppløsning og evne til å skalere opp til større dyr og mennesker 10,11, vil PET danne grunnlaget for det videre arbeidet at vi foreslår kan rette for rask oversettelse av metodene som er utviklet i celler til prekliniske modeller og kliniske applikasjoner.
Protocol
1. Vedlikehold og forplantning av C2C12 myoblasts
- Plate C2C12 myoblaster i en 75 cm 2 kolbe og opprettholde celler i høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagles Serum (HG-DMEM) supplert med føtalt bovint serum (FBS) til en endelig konsentrasjon på 10%. Ikke tillate celler å bli konfluent enhver tid, da dette vil utarme myoblastic befolkningen. Medium bør skiftes hver annen dag. Merk: alltid varm medium til 37 ° C i et vannbad før bruk.
- Når myoblasts blir ca 80% confluent, passasje celler til en ny kolbe. Aspirer kultur medium. Vask celler med 4-5 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS) for å fjerne alle spor av dyrkingsmedium, som inneholder trypsin-inhiberende serum. Kort skyll cellelaget med 2-3 ml 0,25% (w / v) trypsin-EDTA-oppløsning for å dissosiere de adherente myoblaster fra kolben. Aspirer trypsin og sted kolbe i inkubator ved 37 ° C i 5 min.
- I løpet av denne incubasjon, utarbeide en ny kolbe med 9 ml HG-DMEM/10% FBS medium. Etter trypsinering, tilsett 10 ml komplett medium til celler og pipette 4-5 ganger for å sikre samling av alle celler i mediet. Tilsett 1 ml cellesuspensjon til det nye kolben og inkuber i 5% CO 2 ved 37 ° C.
2. C2C12 Cell Transfeksjon
- Når cellene har nådd 50% sammenflyting, transfektere i henhold til produsentens instruksjoner fra Invitrogen. Kort, kombinere 90 ul Lipofectamine 2000 reagens med 4,5 ml OPTI-MEM medium. I et annet rør, kombinere 36 ug CMV-trifusion rapportørgen DNA med 4,5 ml OPTI-MEM. Flick hvert rør å kombinere og vente 5 min. Kombiner innholdet i begge rør, bland forsiktig og inkuber ved romtemperatur i nøyaktig tretti minutter. Merk: En annen kolbe bør også settes opp for untransfected celler som kun mottar Lipofectamine og OPTI-MEM for å tjene som en negativ kontroll.
- Fjern medium fra C2C12 celler og legge 15,5ml frisk HG-DMEM/10% FBS medium. Legg transfeksjon medium for å bringe totalvolumet til 20 ml.
- Tillate celler å transfektere natten for minst 20 timer ved 37 ° C.
- Neste dag, aspirer transfeksjon medium og tilsett 10 ml HG-DMEM/10% FBS.
- Vis celler under en omvendt fluorescerende mikroskop. Fange både lyse felt og røde fluorescens bilder (ved hjelp av en TRITC filter kube, mrfp ex / em: 584/607 nm). Tell antall RFP-uttrykke celler sees under fluorescens delt på totalt antall celler sett i sterkt felt for flere synsfelt for å generere transfeksjon effektivitet.
3. Vurdering av Cell Overlevelsesevne / MTT Assay
- En dag før transfeksjon, plate 1x10 5 C2C12 celler i hver brønn i en 24-brønns plate. Celler bør bli belagt i 500 pl volum i HG-DMEM/10% FBS.
- Neste dag, transfektere myoblaster natten som beskrevet tidligere. Følg produsentens forslag til transfeksjon Reagent volum for en 24-brønns plate. Inkuber et sett av brønner med Lipofectamine bare (ingen DNA) som en kontroll. Vis celler under fluorescens for å sikre at riktig transfeksjon har oppstått.
- Fjern transfeksjon medium og inkuber myoblaster med 5 mg / ml tiazolyl blå tetrazolium bromid (MTT) hos HG-DMEM/10% FBS. Legg D-luciferin til åtte av de transfekterte brønnene og inkuber ved 37 ° C i fire timer.
- Fjern medium fra brønner. Solubilisere blå formazan krystaller ved tilsetning 180 pl isopropanol til hver brønn. Rist ved 37 ° C i 15 min.
- Unngå enhver bunnfall, pipette løsningen i et 96-brønns plate og lese absorbans ved 575 nm.
4. Utarbeidelse av myoblasts for Transplant
- Fjern medium, vask myoblasts med HBSS, og trypsinize celler som beskrevet i 1.1.
- Resuspendere cellene i 4 ml fullstendig medium.
- Ved hjelp av en hemocytometer, telle celler til å generere volumer som inneholder 10 6 myoblasts. Pipette vollumet i sterile 1,5 ml mikrorør. Med en transfeksjon effektivitet ~ 10%, disse verdiene indikerer at 100000 luciferase-uttrykkende celler oppdages på GE ExploreOptix skanneren etter transplantasjon.
- Oppnå en endelig injeksjonsvolum på 15 ul, inneholdende 10 6 C2C12 celler. Hvis nødvendig, sentrifuger mikrorør ved 2000 rpm i ett minutt. Nøye aspirere supernatant med en pipette. Resuspendere cellene i 15 ul HG-DMEM mangler FBS.
5. Cell Implantasjon
- Anesthetize mus med 2% isofluran / 2% O 2. Nappe hår fra dorsal hind lem området. Opprettholde anestesi på 1,5% isofluran / 2% O 2.
- Sikre C2C12 myoblasts er godt suspendert. Med musen i en utsatt posisjon, utvide hind lem og bruke en insulinsprøyte for å injisere cellene direkte inn i laterale hodet av gastrocnemius muskelen i 30 ° vinkel. Injisere transfekterte myoblasts inn i høyre bakben lem og untransfected myoblasts into motsatt (venstre) hind lem.
- Utføre en baseline Bioluminescens scan: Raskt overføre musen til scenen i den optiske skanner, legging musen i en utsatt posisjon. Hekte på bedøvelse linje. For å sikre musen fortsatt bedøvet, bør en annen person være til stede for å koble opp bedøvelse linjen mens de andre stedene dyret i skanneren.
- Forsiktig forlenge hind lem så området av injeksjon er synlig. Tape baklemmene på plass med en svak klebemiddel såsom medisinsk tape.
- Lukk kammeret og sikre at ingen lys kan videre i det indre av skanneren, da dette vil øke bakgrunnen signal oppdaget. Skanneren skal settes til parametre som inngår i produsentens instruksjoner for Bioluminescens imaging. Spesifikt, sikre "ingen laser" er valgt.
- Tegn en region av interesse (ROI) rundt plukket området og start scan.
6. Injeksjon av Fluc Substrat, D-luciferin, inn Mdx Mouse
<ol>7. BLI til Target Luc-uttrykker MPCs Etter Implant inn musemodeller av DMD
- Etter opptaket perioden anesthetize musen igjen, som beskrevet i 5.1.
- Overfør musen tilbake til den optiske scanner og utfører en annen Bioluminescens skanning på samme måte som bakgrunnen skanningen.
- Selv om en 20 min uptake periode bør gi maksimal signalintensiteten, kan en etterfølgende skanning utføres.
- Ved gjennomføring av bildeopptak, ofre musen i henhold til retningslinjer fastsatt av din Institutional Animal komité og den kanadiske Council on Animal Care (CCAC). Isolere hind lem muskler og sted umiddelbart jegn 10% formalin å fikse for parafin forankring. Utfør immunhistokjemi farging for luciferase å bekrefte intramuskulær injeksjon av myoblasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved 50-60% sammenflyting ble C2C12 myoblaster forbigående transfektert med ovennevnte fusion rapportørgen konstruere sammensatt av firefly luciferase [Fluc], monomere rød fluorescerende protein [mrfp] og sr39 tymidinkinase [sr39tk] (figur 1A). Transfeksjon effektivitet ble beregnet via fluorescens mikroskopi (Tall 1B, C), noe som gjør bruk av mrfp sekvensen i reporter vår konstruere. Cell overlevelsesevne ble ikke påvirket av merking med BLI substrat, D-luciferin (figur 1D). Etter transfeksjon ble omtrent 100.000 mrfp-uttrykkende myoblaster implantert intramuskulært i gastrocnemius muskel av MDX mus (bestemt tidligere, manuskript presentert); 100000 untransfected celler ble likeledes implantert i kontralaterale bakben lem som en kontroll. Straks etter celle implantasjon, ble mus injisert intraperitonealt (IP) med 150 mg / kg D-luciferin. Etter en opptak periode ~ 20 min, ble mus avbildet på et lite dyr optisk skanner (GE ExplorOptix svart boks som er utstyrt for levende dyr Bioluminescens og fluorescens). Som tidligere vist, både in vitro og etter implantasjon (manuskript innsendt) opptak av D-luciferin var spesifikk for svingninger-uttrykkende myoblaster, uten påvisbare Bioluminescens i untransfected celler (figur 2). Immunhistokjemi bekreftet intramuskulær transplantasjon av myoblaster (figur 3)
Figur 1 Skjematisk av CMV-trifusion reporteren konstruere (A),. Lysfelt / fluorescens bilder av C2C12 myoblaster transfektert med trifusion reporteren plasmid (B, C); MTT analysen å vurdere C2C12 celle overlevelsesevne etter merking med BLI substrat, D-Lucifer i (D).
Figur 2. Bioluminescens imaging (BLI). En region av interesse (ROI) er trukket til å omslutte plukket hind lem området der myoblasts injiseres (A). Bioluminescens ikke oppdages under en bakgrunn scan (B). På 23 minutter etter injeksjon av D-luciferin, er et klart signal oppdages fra høyre bakben lem hvor luciferase-uttrykke myoblasts injiseres. Ingen Bioluminescens er oppdaget i kontralaterale hind lem injisert med untransfected myoblasts (C). Klikk her for å se større figur .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Figur 3. IHC ved hjelp av en firefly luciferase antistoff bekrefter intramuskulær implantasjon av transfekterte C2C12 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi beskrevet en rask og pålitelig molekylær imaging, reporter genet tilnærming til ikke-invasiv målet myoblasts / MPCs etter en transplantasjon. Mens denne studien viser kortsiktige lokalisering av transplanterte MPCs via bioluminescense imaging (BLI), på hvilken måte celler målrettet kan faktisk lett påføres en langsgående vurdering av celle engraftment gjennom implantasjon av celler som stabilt uttrykte reporteren genet. For dette formål, har vår gruppe generert transgene mus linjer som er bærere av enhetlig reporter genet. Kun celler som uttrykker rapportørgen oksidere D-luciferin å produsere fotoner for visualisering ved hjelp BLI. Siden oksidasjon av D-luciferin er avhengig genekspresjon, er dette en kraftig teknologi som til ikke-invasiv image levedyktige transplanterte cellene. Muskel vev høstet fra disse transgene mus og satellitt celler (SC) isolert via FACS kan faktisk være targeted etter utsetting i MDX mus. I tillegg kan vi spore deres differensiering status gjennom bruk av en muskel-spesifikk promotor, ytterligere høyne nytten og viktigheten av molekylær imaging teknologier, slik som presentert heri, til feltet av DMD forskning (manuskript innsendt). I tillegg til sin hurtighet og lave kostnader, er BLIs giftfri, noe som gjør det til et attraktivt valg for hyppig avbildning av små dyr. Denne funksjonen, så vel som dens høy spesifisitet, vil være uvurderlig i raffinering myoblast erstatning terapi i pre-klinisk sykdom modeller av Duchenne muskeldystrofi før det skifter til klinisk-gjeldende studier med teknologier som PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Sanjiv Gambhir for gaven av fluc/mrfp/sr39tk reporter genet. Dette arbeidet ble finansiert av Stem Cell Network (SCN) i Canada, og The Jesse Journey Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
