Summary
Para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la próstata primeros sistemas innovadores modelos humanos y enfoques cáncer de iniciación, la novela y se necesitan desesperadamente. El potencial de pre-prostática seno urogenital mesénquima (UGSM) para inducir a las poblaciones de células madre pluripotentes para formar el epitelio de próstata humano es una poderosa herramienta experimental en la investigación de próstata.
Abstract
Los avances en la investigación del cáncer de próstata es muy limitada por la disponibilidad de sistemas de modelos de origen humano y de la hormona-naïve, que limitan nuestra capacidad de entender los eventos genéticos y moleculares que subyacen a la próstata inicio de la enfermedad. Hacia el desarrollo de mejores sistemas modelo para el estudio de la carcinogénesis de próstata humano, nosotros y otros han aprovechado la única potencial inductivo pro-prostática de embriones de roedores estroma prostático, denominada seno urogenital mesénquima (UGSM). Cuando se recombina con ciertas poblaciones de células pluripotentes tales como células madre embrionarias, UGSM induce la formación de epitelio humano normal de la próstata de una manera dependiente de la testosterona. Este sistema modelo humano puede utilizarse para investigar y probar experimentalmente la capacidad de los candidatos genes de susceptibilidad al cáncer de próstata a un ritmo acelerado en comparación con los estudios típicos de roedores transgénicos. Dado que las células madre embrionarias humanas (hESCs) pueden ser modificadas genéticamente en la cultura using de expresión génica inducible o siRNA vectores knock-down antes de la recombinación tejido, tal modelo facilita la prueba de las consecuencias funcionales de los genes, o combinaciones de genes, que se piensan para promover o impedir la carcinogénesis.
La técnica de aislar poblaciones puras de células UGSM, sin embargo, es un reto y el aprendizaje a menudo requiere alguien con experiencia anterior para enseñar personalmente. Por otra parte, la inoculación de mezclas de células bajo la cápsula renal de un huésped inmunocomprometido puede ser técnicamente difícil. Aquí describimos e ilustramos el aislamiento adecuado de UGSM a partir de embriones de roedores y renal implantación cápsula de mezclas de tejidos para formar el epitelio prostático humano. Este enfoque, en su fase actual, requiere xenoinjerto in vivo de las células madre embrionarias; aplicaciones futuras podrían incluir potencialmente en la formación de la glándula o el uso in vitro de poblaciones de células madre pluripotentes inducidas (iPS).
Introduction
Hay una tremenda necesidad de mejores sistemas de modelos humanos de cáncer de próstata. En particular, sistemas de modelos humanos pertinentes de tejidos de próstata normales, no malignas que pueden ser manipuladas genéticamente para discernir directamente el papel de genes específicos en la iniciación del cáncer de próstata serían muy informativo. El advenimiento de la era genómica ha identificado numerosos genes que pueden tener un papel en la formación del cáncer. La falta de sistemas de modelos experimentales humanos, sin embargo, perjudica gravemente nuestra capacidad para probar y caracterizar funcionalmente genes candidatos de susceptibilidad al cáncer de próstata. Un sistema modelo ideal sería facilitar los análisis funcionales rápidos y más rápida de genes de susceptibilidad al cáncer en combinación con sistemas de modelos de roedores transgénicos adecuados. Por otra parte, un sistema modelo humano tal permitiría la caracterización molecular de los mecanismos de señalización de la carcinogénesis de próstata hacia el descubrimiento y validación de nuevas terapias paraevitar la formación de cáncer de próstata.
Células madre embrionarias humanas (hESCs) son capaces de formar los tejidos prostáticos humanos como xenoinjertos. En 2006 Taylor, et al. Informó que hESCs pueden ser inducidas a formar epitelios de próstata in vivo cuando se re-combinado con roedores seno urogenital mesénquima (UGSM) dentro de un período de tiempo de 8-12 semanas. 1 Estos estudios se basaban en el trabajo previo de el laboratorio Cunha que muestra que roedores UGSM embrionario puede promover la diferenciación de las células madre de próstata y poblaciones de células epiteliales embrionarias in vivo. 2,3 La próstata se desarrolla a partir de un Anlagen embrionario denominado el seno urogenital (UGS), y antes de que el día embrionario 17 (E17 ratón ; día E18 en la rata) el UGS se pueden quitar y divididos físicamente en el epitelio (UGSE) y el mesénquima (UGSM) 4 Este enfoque recombinación tejido ha mejorado significativamente nuestra comprensión del desarrollo y la carcinogénesis de próstata, en particular.factor de crecimiento de LY y vías de señalización hormonales y las relaciones moleculares entre la próstata estroma y el epitelio. 5-8 Este método implica la combinación ex vivo de UGSM con tallo o células epiteliales de las mismas o distintas especies y estos recombinantes celulares / tejido se implantan y se cultivaron y xenoinjertos en ratón huésped. 4,9 Después de un período de crecimiento in vivo, el implante contiene próstata estructuras glandulares epiteliales incrustados en el tejido del estroma. Además tinción puede llevarse a cabo para determinar si tales estructuras son verdaderamente prostática y de origen humano. 10,11
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Chicago Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, números de protocolo 72066 y 72231). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. La madre de embriones humanos línea celular WA01 (H1; NIH-registro # 0043) fue adquirido de WiCell (Madison, WI) y se cultivaron usando el protocolo de alimentación independiente con mTeSR1 medios (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). Las células ES se utilizaron dentro de los diez pasajes de descongelación.
1. El aislamiento del seno urogenital de ratón o rata embriones
- La eutanasia a un ratón temporizada embarazadas (17,5 días) o la rata (18,5 días) por inhalación de CO 2 durante 5 min. La muerte se confirma por el cese de los signos vitales en la rata. A continuación, cortar la cabeza humana. El ra es la eutanasia en este punto. Pulverizar etanol al 70% para esterilizar la piel del abdomen y los flancos. Cortar la piel del abdomen y las capas de músculo y luego se corta el útero, separe los embriones de rata de la bolsa amniótica, y cortar el cordón umbilical. La transferencia de los embriones en un tubo Falcon de 50 ml que contenía solución salina equilibrada de Hank enfriada en hielo (HBSS) y mantener en hielo. Los fetos son sacrificados por decapitación con tijeras quirúrgicas.
- Coloque el embrión en 100 mm de placa de Petri. Biseccionar el embrión con las tijeras en el nivel del ombligo (Figura 1A). Retire el estómago y el intestino delgado. Revelar los ovarios en el embrión femenino y testículos en el embrión masculino (Figura 1B y 1C). (Los ovarios están ubicados en los polos caudal de los riñones. Los testículos son aproximadamente al nivel de la vejiga). En esta etapa de desarrollo, aislado UGSM de ambos embriones macho y hembra son capaces de inducir un linaje epitelial prostática en presencia de anfitrióntestosterona. 4 Después de este punto en el tiempo de desarrollo, sin embargo, las yemas prostáticas comenzar a formar en el UGSM, y el aislamiento de UGSM puro es muy difícil. 4
- Bajo el microscopio de disección, corte de la pared abdominal en la línea media con unas tijeras Vannas para exponer la vejiga y de la pared posterior del abdomen. Libre el tracto genital superior de los apegos (embriones masculinos, cortó el uréter, el conducto de Wolff y de Müller conducto, en los embriones femeninos, corte el uréter y conductos de Müller). Libera la vejiga del cordón umbilical. Cortar hueso púbico y sin rodeos separada de la pared anterior del seno urogenital con pinzas de punta fina Dumont. Por último, separar la pared posterior del seno urogenital del recto. Cortar el seno urogenital con la vejiga en el extremo inferior (de la uretra) y almacenar el seno urogenital en bloque (con la vejiga) en HBSS frío de hielo.
2. La separación del mesénquima seno urogenital
- Transferir el seno urogenital a un tubo Falcon que contiene 1% de tripsina en calcio (Ca 2 +) y magnesio (Mg 2 +) HBSS libre. Colocar el tubo en un refrigerador a 4 º C durante 75 min.
- Retire la tripsina y neutralizar tripsinización con 10% de suero de Bovin fetal (FBS) en medio DMEM/F12.
- El pelo con cuidado el manguito mesenquimal pegajosa del tubo epitelial con una aguja o Dumont fórceps de punta fina (manteniendo el tubo epitelial intacta reduce las posibilidades de contaminación de células epiteliales del mesénquima, lo que puede resultar en la formación de las glándulas de roedores, junto con su tallo derivado de células humana epitelio glandular) (Figura 1D). 12
- Transferencia UGSM en un nuevo tubo Falcon que contiene medio DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep; 0,5 mg / ml) + 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), además de 1 nM R1881. Plas el tubo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante la noche.
- Se centrifuga el tejido a 200 xg y descartar el sobrenadante. Lavar con tampón fosfato salino (PBS) (no perturbar el sedimento de tejido).
- Añadir 0,2% de colagenasa (en DMEM/F12) para volver a suspender el tejido. Incubar en 37 ° C con agitación suave durante 1 hora.
- Vórtice vigorosamente el tejido digestión tres veces hasta que se convierte mezcla homogénea de una sola célula y añadir medio DMEM/F12 + 10% de FBS + 1% P / S + 1% de NEAA + 1 nM R1881 para neutralizar la colagenasa.
- Centrifugar a 200 xg y lavar por la re-suspensión de las células UGSM en HBSS, y repetir tres veces para lavar totalmente el UGSM. Finalmente suspender las células mesenquimales en DMEM/F12 y contar las células usando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células.
- Disociar HES células cultivadas usando el protocolo de enlace de conexión con mTeSR1 medios (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) utilizando una digestión Accutase (Millipore, Billerica, MA). Lavar las células hESdurante la fase logarítmica de su crecimiento en medio DMEM/F12 cálidos, a continuación, agregar solución Accutase 1x caliente, y se incuba a 37 ° C durante 15-20 minutos hasta que las células individuales son uniformemente disociada de colonias. Añadir la misma cantidad de 1x definido inhibidor de tripsina (Invitrogen, Grand Island, NY) para neutralizar el Accutase y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar y romper los grumos de células. Células pipeta en un tubo de centrífuga y centrifugar durante 3 minutos a 200 xg, y volver a suspender el sedimento celular en medio DMEM/F12. Centrifugar tubo durante 3 minutos a 200 xg una y separar el sobrenadante y vuelva a suspender en HBSS frío o DMEM/F12 al volumen deseado.
- Añadir HES células con relación 1:2,5 de HES / células mesenquimales. 3 Esta será una composición celular de las células 1E 5 UGSM con 4E 4 hESCs por inyección de 10 ml (una sola rata UGS típicamente rendimientos de alrededor de 6 células mesenquimales 2E). Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos y después se desecha el sobrenadante. Vuelva a suspender el 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, mezclado con 25% HBSS frío para un manejo más fácil) y colocar el tubo en hielo durante la inyección cápsula sub-renal.
3. Trasplante de tejido recombinante Por debajo de la cápsula renal
- Prepare un área quirúrgica estéril.
- Anestesie un ratón nude atímicos macho con ip ketamina / xilazina, el uso de una mezcla fresca que contiene una proporción de 01:01:08 ketamina: xilazina: solución salina. La dosificación será 100 mg / kg de ketamina y 2,5 mg / kg de xilazina. Los animales que no responden a un dedo del pie para los dedos deben estar totalmente bajo durante 20-30 min.
- Quirúrgicamente preparar el ratón por el afeitado de la zona quirúrgica (si no está usando un ratón desnudo), la limpieza con tres paños alternados de alcohol al 70% seguido de solución de betadine y la aplicación de un paño quirúrgico.
- Ponga la humedad colirio (pomada para los ojos Altalube) a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la anestesia.
- Durante la cirugía, la tasa de respiración y la temperatura corporal central de los ratones son monitoreados. Las tasas de respiración should ser constante y mantenerse dentro de 40 a 90 respiraciones / min. La temperatura corporal central se controla con la observación del color de las membranas mucosas y las plantas de los pies de color rosa.
- Hacer un cm de largo incisión longitudinal 1.0 en la parte posterior. Continuar para cortar la pared abdominal en una incisión longitudinal de 0,5 cm.
- Apriete suavemente el riñón fuera del abdomen y mantener la humedad de la superficie del riñón usando gotas de solución salina estéril.
- Suavemente perforar la cápsula renal con una aguja de jeringa de calibre 27 vacía. Una punción muy superficial es suficiente. Este será el lugar donde se inserta la aguja roma para inyectar la mezcla celular.
- Llene una jeringa con aguja roma de calibre 28 con 10 l de la mezcla de células. Inserte lentamente la zona de punción y penetrar en el parénquima renal para llegar a un área por debajo de la cápsula renal. Inyectar 10 l de la mezcla celular para formar un bolo en el riñón por debajo de la cápsula renal. Retirada de la aguja.
- Devuelva el riñón a la abdocavidad del terminal. Asegure la capa muscular del peritoneo con sutura de nylon 4-0.
- Cierre de la piel, ya sea con suturas o grapas.
- Limpiar la sangre de la piel usando solución salina estéril.
4. Analgesia postoperatoria y Monitoreo
- Inyectar el animal con buprenorfina (0,1 mg / kg cada 12 h) o ketoprofeno (3-5 mg / kg en solución salina cada 12 h) para controlar el dolor post-operatorio, y 1 ml de 37 ° C IP solución salina para mantener caliente el animal y prevenir la deshidratación.
- Coloque el animal en una jaula limpia y colocarlo en una almohadilla eléctrica leve.
- Enviar a los animales de vuelta a la sala de los animales una vez que recobren el conocimiento y se mueven dentro de la jaula.
- Observe que el animal diariamente para detectar signos inesperados de enfermedades e infecciones de los tres días siguientes. Los ratones se controlan con la observación de las actividades en jaulas incluyendo comida acceso y agua de 1 día después de la operación. Si los ratones muestran menos actividades, ketoprofeno es intraperitoneal administró de nuevo una vez al día.
- Retire las grapas o suturas cutáneas 2 semanas después de la cirugía.
- Tejidos xenoinjertos se pueden cosechar a las 8 semanas después de la cirugía. Los xenoinjertos se pueden obtener imágenes in vivo utilizando ultrasonido de pequeños animales (Figura 2A), y los tejidos fijos pueden ser seccionadas y teñidas para diversas proteínas mediante inmunohistoquímica (Figura 3).
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Representative Results
Basándose en el informe apasionante por Taylor, et al., Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo de injerto mediante el H1 de uso común (NIH-WA01 designado, genéticamente masculino) línea de células madre embrionarias humanas. 1 Esta línea ha sido rigurosamente probado para el control de calidad y es cariotipo normal de 13 Cuando se cultiva adecuadamente, HES células se pueden mantener, ampliar y criopreservados en un estado indiferenciado y pluripotente mediante un método de cultivo libre de alimentación (sistemas de alimentación libres disponibles en el mercado a través de Stem Cell Technologies, Vancouver BC). 14. Nuestro protocolo emplea suspensiones de células individuales de hESCs combinados con suspensiones de células individuales de rata E18 UGSM y se inyecta bajo la cápsula renal de ratones machos adultos inmunocomprometidos. Como controles importantes, USGM implanta solo produce ningún crecimiento apreciable, mientras que hESCs implantan sin forma UGSM grandes teratomas (Figura 2B). 15 En nuestra experiencia, el implanteación de UGSM sin contaminación de las células epiteliales de rata nunca resulta en el crecimiento del tejido, mientras que la recombinación de UGSM más hESCs resultados en el crecimiento robusto más del 80% del tiempo (después de 8 semanas tamaños van desde 1 mm a 5 mm, con más del 80% del tejido que contiene epitelio glandular). En los recombinantes que contienen ambos hESCs y UGSM, formación glandular temprano se observó después de 4 semanas, y después de 8 semanas completamente formados, se forma el antígeno prostático específico (PSA)-positivo epitelio de próstata humano (Figura 3). Estas glándulas contienen receptor de andrógenos (AR)-positivas las células secretoras luminal-que no están presentes una semana después de la castración de acogida. Es importante destacar que estas glándulas son positivos para el ser humano-específica y de la próstata-específico de la proteína PSA. Otros documentos de tinción que tales glándulas humanos parecen ser no malignas, ya que no expresan alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR), que es un marcador específico del cáncer de próstata. 16
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Figura 1. Aislamiento del seno urogenital de un embrión de rata E18.5. A. E18.5 embrión de rata. La línea sólida blanca indica la posición de dividir en dos el embrión. B. E18.5 embrión de rata macho. Las líneas de puntos negros indican la vejiga, seno urogenital, el recto, y los testículos en desarrollo. C. E18.5 embrión de rata hembra. Las líneas de puntos negros indican la vejiga, seno urogenital y el útero. D. La vejiga y el seno urogenital retirado del embrión de rata E18.5. La línea continua, mientras que indica la posición para extraer la vejiga. La línea de puntos negro y la flecha blanca indica el tubo epitelial. La punta de la flecha blanca indica el mesénquima del seno urogenital.
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Figura 2. Las imágenes por ultrasonido y la morfología bruta del tejido in vivo en xenoinjertos derivados de UGSM y hESCs. A. Las imágenes por ultrasonido de xenoinjertos de crecimiento permite análisis de animales vivos durante el curso del experimento. La imagen fue capturada 8 semanas después de la cirugía utilizando un ultrasonido 2100 de pequeños animales Vevo (Visualsonics, Toronto, ON). . Zonas marcadas con círculos representa el crecimiento de xenoinjerto de tejido en la superficie del riñón B. En el punto final experimental, HES células combinadas con UGSM rata (rUGSM) forman una masa visible en la superficie del tejido renal (panel de la izquierda); HES células implantadas solo formar grandes teratomas como espera (panel central), y UGSM implantado por sí sola no para formar cualquier estructura discernible (panel derecho).
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Figura 3. Formación de Recursos Humanos de próstata epitelio de la célula embrionaria Line WA01 madre humanas (H1). Células madre embrionarias se recombina con UGSM roedores y se implanta debajo de la cápsula renal de ratones desnudos machos intactos. Después de un periodo de crecimiento de 8 semanas, se forma el epitelio glandular prostático humano según lo documentado por AR, p63, y la tinción de PSA humano restringido. Una semana después de la castración de acogida, la capa luminal AR-positivo, PSA-positivo no está presente, la documentación de característica de dependencia de andrógenos. Tejidos de próstata no son malignos, como lo demuestra la falta de tinción AMACR. Además, las células neuroendocrinas Chra-positivos fueron detectables. Tejido de la próstata humana no maligna se utilizó como control para la AR, PSA, y p63; un tumor de próstata se utilizó como un control positivo para AMACR específica del cáncer.
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Discussion
Tejido por medio de recombinación UGSM es una técnica muy útil para investigar el desarrollo de la próstata y los eventos moleculares que conducen a la iniciación del cáncer de próstata. El potencial inductivo de UGSM se ha utilizado en numerosas aplicaciones en la investigación de próstata, que incluyen la mejora del tumor toma de líneas celulares de próstata y tumores, el estudio de las interacciones epiteliales del estroma-, y la formación de recombinantes de próstata de especies cruzadas 7,17-20 La preparación adecuada de UGSM. Sin embargo, es fundamental para el éxito experimental como contaminante epitelio roedores se traducirá en la formación glandular y puede confundir los resultados. Por lo tanto, la separación de la UGSM de la UGSE (Paso 2.4) es, con mucho, el paso más complicado más crítico y también en el protocolo. Para el control de dicha contaminación, se recomienda encarecidamente el uso de técnicas para discernir entre las especies, así como un brazo experimental adicional utilizando UGSM solo para documentar sin formación glandular de cellulacontaminantes r 12.
El reciente desarrollo de la alimentación libre de HES reactivos y métodos de cultivo permite puros células hES poblaciones a ser cultivadas, ampliada y criopreservados. 14 Por otra parte, el mayor uso de la entrega de genes lentiviral permite la incorporación genómica estable y la expresión de los genes de interés. 21,22 Estos avances combinados permiten la manipulación genética de cultivos puros HES y, cuando se combina con el potencial inductivo de UGSM embrionario prostática, permitirá la generación in vivo de las glándulas prostáticas humanas que expresan genes específicos de interés en. Por otra parte, esta técnica sería susceptible de líneas de células madre pluripotentes inducida-(CMPI) derivados de hospedadores adultos y a partir de células modificadas genéticamente. 23,24 Uso de proteínas definidas, se muestra que tales epitelio de próstata humano derivado de células madre parece muy similar a adultos próstata humana epitelios, pero a un nivel molecular mundial no es seguro que seráalgunas diferencias en la expresión génica que se deben tener en cuenta. Para dar cuenta de esto, los investigadores deben utilizar un tamaño de la muestra expandida y considerar microdisección láser captura (LCM) a base de enfoques y de expresión génica análisis comparativos plataformas para validar los perfiles moleculares de los tejidos en comparación con los tejidos humanos adultos. No obstante, la formación de epitelio glandular de la próstata humana utilizando una línea de células madre cultivadas en serie y el alimentador-libre tiene el potencial de facilitar numerosos estudios moleculares relativas a la función de la próstata y la iniciación del cáncer.
Nuestra técnica utiliza suspensiones de células individuales de tanto UGSM y hESCs, que permite el uso de la infección lentiviral y el flujo de clasificación enfoques, así como el control más preciso de las cantidades celulares. Esto puede, sin embargo, disminuir el potencial inductivo de UGSM. Un enfoque alternativo ha sido la utilización de UGSM no disociada (después de la Etapa 2.5), antes de la digestión de colagenasa)y, o bien la incubación directa con las células ES, o embebiendo a las células dentro de una solución de colágeno. 4 Para implantar estos tejidos bajo la cápsula renal, una técnica alternativa sería hacer una incisión en la cápsula renal, creando un pequeño espacio debajo de la cápsula renal en la parte superior de los riñones, y el lugar físico de la masa celular en ese bolsillo. 4,20
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses con el trabajo presentado.
Acknowledgments
Queremos agradecer el apoyo de la Universidad de Chicago Sección de Urología dirigido por el Dr. Arieh Shalhav, y el Director de Investigación Urológica Dr. Carrie Rinker-Schaeffer. También nos gustaría agradecer el apoyo de la Universidad del Centro Integral del Cáncer de Chicago (UCCCC), dirigido por la Dra. Michelle Le Beau. También dar las gracias a la asistencia técnica de expertos de la instalación Human Tissue Resource Center básico dirigido por el Dr. Mark Lingen, y la ayuda de Leslie Martin y Mary Jo Fekete. También agradecemos a la facilidad de la base inmunohistoquímica dirigido por Terri Li. Este trabajo fue financiado por la Universidad del Departamento de Cirugía de Chicago, la Sección de Urología, la Sociedad Americana del Cáncer Beca de Investigación Institucional (ACS-IRG, # IRG-58-004), un Centro del Cáncer de Apoyo Grant (P30 CA14599); El Brinson Fundación, el Fondo Alvin Baum Familia, la Universidad de Chicago Board Cancer Research Foundation de la Mujer; S. Kregel el apoyo de un HHMI: Med-en-Grad becarioscadera (56006772) y Biología del Cáncer Training Grant (T32-CA09594). Por último, nos gustaría dar las gracias a Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan y Nathan Stadick para su evaluación crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
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