人类前列腺上皮细胞形成的使用鼠类泌尿生殖窦间质细胞和人类干细胞的组织重组

该程序的总体目标是从啮齿动物胚胎中分离啮齿动物泌尿生殖系统、窦间充质或 UGSM，并将组织混合物植入可形成人前列腺上皮的肾包膜中。这是通过首先从小鼠或大鼠胚胎中分离泌尿生殖窦来实现的。接下来，泌尿生殖窦间充质与上皮分离。

然后将泌尿生殖窦间充质的单细胞悬液与多能干细胞结合。最后，将细胞混合物植入宿主小鼠的肾包膜下。最终，通过验证人类特异性 PSA 表达，可以获得显示小鼠肾脏上形成人类前列腺上皮的结果。

虽然这种方法可以提供对前列腺功能和疾病发作的见解，但它也可以应用于其他系统，例如人类前列腺肿瘤的异种移植和每周诱导致瘤细胞系形成肿瘤。对定时怀孕的小鼠或大鼠实施安乐死并分离胚胎后，将它们与羊膜袋分离，剪断脐带并将它们转移到装有冰冷面纱的 50 毫升管中。平衡盐溶液并保持在冰上。

将胚胎放入 100 毫米培养皿中，并使用剪刀在推注水平将其一分为二。切除胃和小肠，然后在雌性胚胎中找到卵巢，这些卵巢位于肾脏的腈极或位于膀胱水平的雄性睾丸。在解剖范围下。

用威尼斯剪刀剪断腹壁，露出膀胱和腹部后壁。将上生殖道从附件中释放出来，并释放脐带。切开耻骨，用 dumont 细尖镊子。

直截了当地将其与泌尿生殖窦的前壁分离。将泌尿生殖窦后壁与直肠分开，切开泌尿生殖窦，膀胱位于下端。然后将膀胱与泌尿生殖窦分开。

将泌尿生殖窦储存在冰冷的 HBSS 中。将泌尿生殖窦转移到含有 1% 胰蛋白酶的 HBSS 溶液（不含钙和镁）的 50 毫升试管中，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，去除胰蛋白酶，加入 10% FBS 和 DM A MF 12 培养基以中和消化。

接下来，使用针头或细尖镊子小心地从上皮管中梳理粘稠的间充质袖管。保持上皮管完整可降低间充质上皮细胞污染的机会。这可能导致啮齿动物腺体与干细胞衍生的人腺上皮一起形成。

将 UGSM 转移到含有 DMM F 12 培养基的新 50 毫升试管中，该培养基含有 10% FBS、1% 笔链球菌、1% 非必需氨基酸和 1 纳摩尔。R 1 8 81 将试管在 37 摄氏度下与 5% CO2 孵育过夜。第二天，将组织以 200 G 离心，弃去上清液，使用 PBS 洗涤沉淀。

去除 PBS 后，将组织重悬于 D-M-A-M-F 12 中的 0.2% 胶原酶中，并在 37 摄氏度下轻轻摇动孵育 1 小时，剧烈涡旋消化组织 3 次，直到它变成均匀的单细胞混合物，并通过添加含有 10% FBS、1%pen 链球菌、1% 非必需氨基酸和 1 纳摩尔 R 1、8、81 的 D-M-A-M-F 12 培养基来中和胶原酶。通过在 200 G 下沉淀细胞并将它们悬浮在 HBSS 中，将细胞洗涤 3 次。最后，复苏，将间充质细胞悬浮在 DMM F 12 中，并使用血细胞计数器计数以进行移植。

在准备无菌手术区域并用氯胺酮甲苯噻嗪 IP 注射麻醉雄性无胸腺裸鼠后，根据文本方案，进行脚趾捏合以确认镇静水平 手术准备小鼠，如有必要，剃掉手术部位，并交替用 70% 酒精擦拭三次清洁，然后用 Betadine 溶液清洁。涂眼膏后，在背部做一个 1 厘米的纵向切口，继续用 0.5 厘米的纵向切口切开腹壁。轻轻地将肾脏从腹部挤出，并使用无菌盐水滴剂保持湿润。

接下来，使用 27 号注射器针头轻轻刺穿肾包膜，为细胞混合物创建一个注射部位。然后在 28 号注射器针头中加入 10 微升细胞混合物，并将其缓慢插入穿刺部位，穿透肾实质。到达肾包膜下方的区域。

注射 10 微升细胞混合物，在肾包膜下方的肾脏上形成推注，然后拔出针头。将肾脏返回腹腔，并用四根尼龙缝合线固定腹膜的肌肉层。用缝合线或订书钉缝合皮肤，并使用无菌盐水清除皮肤上的血液。

这里显示的是植入 8 周后生长的异种移植物的超声图像。带圆圈的区域代表肾脏表面的异种移植物。这些图像显示了肾脏表面的异种移植生长。

12 周后，在没有泌尿生殖窦、间充质的情况下植入人 ES 细胞会形成大畸胎瘤，而单独植入的泌尿生殖窦间充质将无法形成任何可辨别的结构。显示在中间。该图的面板是干细胞来源的人前列腺上皮与成人前列腺组织的代表性免疫组织化学染色。

如左图所示，腺体包含一个 AR 阳性管腔上皮层。这也是 PSA 阳性、P 63 阳性基底上皮细胞层和罕见的嗜铬粒蛋白。A 神经内分泌细胞，腺体不是癌症，如宿主去势时 A-M-A-C-R 阴性染色所示。

AR PSA 阳性管腔细胞不再存在，表明具有特征性的雄激素依赖性。在尝试此程序时，重要的是要记住在分离泌尿生殖窦间充质与上皮细胞时要非常小心。由于污染的泌尿生殖窦上皮会形成腺体并可能混淆您的结果。