利用啮齿类动物泌尿生殖窦间质与人类干细胞的组织重组形成人类前列腺上皮

本实验的总体目标是从啮齿类动物胚胎中分离尿生殖窦间充质（UGSM），并将组织混合物植入肾包膜下，以诱导形成人类前列腺上皮。该过程首先从大鼠或小鼠胚胎中分离尿生殖窦，随后将尿生殖窦间充质与上皮组织分离。

然后将泌尿生殖窦间充质的单细胞悬液与多能干细胞混合。最后，将细胞混合物植入宿主小鼠的肾包膜下。最终，可通过验证人特异性PSA的表达，获得显示在小鼠肾脏上形成人前列腺上皮的结果。

尽管该方法可为前列腺功能及疾病发生的研究提供见解，但也适用于其他系统，例如人源前列腺肿瘤的异种移植以及诱导每周致瘤细胞系形成肿瘤。在处死特定孕周的小鼠或大鼠并分离出胚胎后，将胚胎从羊膜囊中取出，剪断脐带，转移至含有冰上预冷的 Hank's 平衡盐溶液的 50 毫升离心管中，并置于冰上保存。

将胚胎放入一个100毫米的培养皿中，使用剪刀在食糜水平处将其切为两半。移除胃和小肠，然后在雌性胚胎中定位卵巢，卵巢位于肾脏的尾极；在雄性胚胎中则定位睾丸，睾丸位于膀胱水平处。在解剖显微镜下操作。

使用维纳斯剪刀剪开腹壁，暴露膀胱及腹后壁。从附着处游离上生殖道，并游离脐带。用 Dumont 精细尖镊子剪断耻骨。

钝性分离尿生殖窦前壁。将尿生殖窦后壁与直肠分离，并在下端连同膀胱一并切断尿生殖窦。随后将膀胱与尿生殖窦分离。

将泌尿生殖窦组织置于冰上预冷的HBSS中保存。将泌尿生殖窦转移至含有无钙镁HBSS的50毫升离心管中，加入1%胰蛋白酶，于4°C孵育30分钟。孵育结束后，吸除胰蛋白酶溶液，加入10%FBS和DMEM/F12培养基以中和消化反应。

接下来，使用针头或精细镊子小心地将黏性的间充质套膜从上皮管中分离。保持上皮管完整可降低上皮细胞污染间充质组织的风险，否则可能导致啮齿类动物腺体与干细胞来源的人类腺上皮共同形成。

将UGSM转移至含有DMM F12培养基的新50毫升离心管中，该培养基包含10% FBS、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1纳米摩尔R1881。将离心管置于37摄氏度、5% CO2条件下过夜培养。次日，在200 × g条件下离心组织，弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀。

去除 PBS 后，将组织重悬于含 0.2% 胶原酶的 D-M-A-M-F 12 培养基中，37°C 条件下轻柔摇动孵育 1 小时，期间剧烈涡旋振荡消化组织三次，直至形成均一的单细胞混合物，然后加入含 10% FBS、1% 青霉素-链霉素、1% 非必需氨基酸和 1 纳摩尔 R 1 8 81 的 D-M-A-M-F 12 培养基以中和胶原酶活性。通过在 200 ×g 离心沉淀细胞，并用 HBSS 重悬，洗涤细胞三次。最后，将间充质细胞重悬于 DMM F 12 培养基中，使用血细胞计数板进行细胞计数，以用于后续移植操作。

根据文本方案，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪对雄性裸鼠进行麻醉，并准备无菌手术区域后，实施脚趾夹捏以确认麻醉程度。必要时剃除手术部位的毛发，并用70%酒精和聚维酮碘溶液交替擦拭三次，对小鼠进行手术准备。涂抹眼膏后，在背部做一厘米纵向切口，随后在腹壁做0.5厘米纵向切口。轻柔地将肾脏从腹腔挤出，并使用无菌生理盐水滴加以保持湿润。

接下来，使用27号注射器针头轻轻刺破肾包膜，以创建细胞混合物的注射位点。然后用28号注射器针头吸取10 µL细胞混合物，缓慢插入穿刺部位，穿透肾实质，到达肾包膜下方区域。

注射10微升细胞混合物，在肾被膜下方的肾脏部位形成团注，并撤出针头。将肾脏放回腹腔内，用4-0尼龙缝线缝合腹膜的肌层。使用缝线或缝钉关闭皮肤，并用无菌生理盐水清洗皮肤表面的血液。

图中显示的是移植八周后正在生长的异种移植瘤的超声图像。圆圈区域代表位于肾脏表面的异种移植瘤。这些图像展示了异种移植瘤在肾脏表面的生长情况。

12周后，未与泌尿生殖窦间充质共同移植的人类胚胎干细胞会形成较大的畸胎瘤，而单独移植的泌尿生殖窦间充质则无法形成任何可辨识的结构。图中显示于中央位置。该图各面板为代表性的免疫组织化学染色结果，比较了干细胞衍生的人类前列腺上皮与成人人类前列腺组织。

如左侧所示，这些腺体包含 AR 阳性的腔面型上皮层，该层也呈 PSA 阳性，以及 P63 阳性的基底上皮细胞层和极少数嗜铬粒蛋白阳性的神经内分泌细胞；由于在宿主去势后显示 AMACR 染色阴性，表明这些腺体并未发生癌变。

AR PSA 阳性的腔内细胞已不再存在，表明其具有典型的雄激素依赖性。在进行此操作时，务必格外小心地将泌尿生殖窦间充质与上皮组织分离，因为污染的泌尿生殖窦上皮会形成腺体，可能干扰实验结果。