Summary
في هذه الورقة، نقدم طريقة لتحليل microvessels الورم في الجسم الحي باستخدام ديناميكية محسنة النقيض مضان videomicroscopy. تم الحصول على معلمتين الكمية: الكثافة الشعرية الفنية التي تعكس الأوعية الدموية للورم، وتسرب مؤشر يعكس التسرب من الجدار البطانية.
Abstract
فيبيريد متحد البؤر مضان في الجسم الحي التصوير مع حزمة من الألياف البصرية تستخدم نفس المبدأ الفلورسنت متحد البؤر المجهري. ويمكن ان تثير الفلورسنت في عناصر الموقعية من خلال الألياف البصرية، ومن ثم تسجيل بعض الفوتونات المنبعثة، عبر نفس الألياف البصرية. مصدر الضوء هو ليزر الذي يرسل الضوء من خلال إثارة عنصر ضمن حزمة من الألياف وكما يمسح على عينة، وبإعادة بكسل الصورة عن طريق بكسل. لأن هذا المسح هو سريع جدا، من خلال الجمع بين ذلك مع مكرسة برامج معالجة الصور، ويمكن الحصول على الصور في الوقت الحقيقي مع تواتر 12 لقطة / ثانية.
قمنا بتطوير تقنية لوصف كميا التشكل الشعري وظيفة، وذلك باستخدام جهاز مضان videomicroscopy متحد البؤر. كانت الخطوة الأولى في تجربتنا لتسجيل 5 أفلام ثانية في الأرباع الأربعة من الورم لتصور شبكة الشعرية. تم تجهيز جميع الأفلام باستخدام برنامج (ImageCell، ماونا كيا التكنولوجيا، فرنسا باريس) أن ينفذ تجزئة الآلي السفن في جميع أنحاء قطر المختار (10 ميكرومتر في حالتنا). وبالتالي، فإننا لا يمكن قياس "الكثافة الشعرية الفنية"، والذي هو النسبة بين منطقة السفينة ومجموع المساحة الكلية للصورة. كان هذه المعلمة علامة بديلة للكثافة الاوعية الدموية الدقيقة، وعادة ما تقاس باستخدام أدوات علم الأمراض.
كانت الخطوة الثانية لتسجيل الأفلام من الورم أكثر من 20 دقيقة لقياس التسرب من وكيل النقيض من الجزيئات من خلال جدار الشعيرات الدموية في النسيج الخلالي. عن طريق قياس نسبة كثافة إشارة في النسيج الخلالي على أنه في الأوعية، وحصلت على "تسرب مؤشر '، التي تعمل كمؤشر بديل لنفاذية الشعيرات الدموية.
Introduction
الأوعية الدموية هي عملية معقدة 1 التي تنطوي على تشكيل أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة من قبل. التغيرات المرضية في الأنسجة دوران الأوعية الدقيقة، التي تتألف من الشرايين، الشعيرات الدموية، والأوردة، وتورط في طائفة واسعة من الأمراض مثل السرطان، والتهاب، أو مرض السكري. وبالتالي فإنه لا بد من تطوير أساليب لتقييم كمي لهيكل microvessel وظيفة. التصوير تمكن من دراسة microvessels في غير الغازية أو الجزئي الطريقة، في الوقت الحقيقي والحية، والتدابير المتكررة على مر الزمن في نفس الحيوان 2.
حاليا، ديناميكية محسنة النقيض (DCE) التصوير 3 يستخدم عادة لتقييم دوران الأوعية الدقيقة الأنسجة. التصوير محسنة تباين ديناميكية هو الأسلوب الذي يتبع مع مرور الوقت biodistribution من التتبع حقن عن طريق الوريد. من هذه الصفقة، المعلمات الكمي يمكن استخلاصها مما يعكس الأوعية الدموية الأنسجة. DCE التصويروقد غالبا ما تستخدم مع CT، MRI أو الموجات فوق الصوتية. ومع ذلك، وهذه تقنيات التصوير لا تسمح بالاطلاع المباشر على microvessels، منذ حلها، بخلاف مع استخدام أجهزة تجريبية محددة، وغالبا ما يبقى العيانية.
في هذه الورقة، فإننا نقترح لدراسة الأوعية الدموية السرطانية على المستوى المجهري والحية باستخدام التصوير الضوئي الديناميكي محسنة النقيض من ذلك، مع فيبيريد videomicroscopy متحد البؤر. استخدمنا عامل تباين الجزيئات (FITC-ديكستران) التي لا تزال حصرا داخل الأوعية أو التسريبات من خلال حاجز غشائي في النسيج الخلالي، وفقا لثقلها الجزيئي وخصائص البطانة من الأنسجة درس 4. هذا يسمح للدراسة على حد سواء هيكل microvessel، من خلال ترسيم السفن بشكل صحيح، ونفاذية الشعيرات الدموية، من خلال تسريب وتتراكم في النسيج الخلالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وكيل التباين
- لFITC-ديكستران 70 كيلو دالتون، وجرعة حقن 500 ملغم / كغم (10 ملغ من FITC-ديكستران المخفف في 0.1 مل من المياه المالحة للماوس وزنها 20 غراما).
- لا ينبغي أن يتعرض وكيل وقتا طويلا للضوء. لتجنب التبييض، فمن المستحسن لتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
2. خدر
- تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط 1:4 من زيلازين (Rompun 2٪، وباير، بوتو، فرنسا) والكيتامين (500 الكيتامين، Virbac، كارو، فرنسا)، على التوالي 66 ملغ / كغ و 264 ملغ / كغ ل20 ز الماوس.
3. إعداد الجهاز من الفائدة
- نحن حليق الفئران في الموقع من الفائدة (على سبيل المثال، أكثر من ورم تحت الجلد). وبر هو في كثير من الأحيان لصناعة السيارات في فلوري عندما الأبيض. عندما الأسود، فإنه يمتص الضوء.
- كان قطعي الجلد التي تواجه الجهاز ليتم تصويرها. من المهم الانتظار حتى تنزفز قد توقف قبل حقن عامل تباين، وإلا فإنه سوف يتسرب في الدم وتلوث الصورة.
4. اكتساب
- تم حقن عامل تباين إما عن طريق الوريد الوداجي أو الوريد الذيلية. ليس هناك القليل أو إشارة الخلفية في الجهاز لوحظت في حالة عدم وجود وكيل النقيض الفلورسنت.
- وضعت لجنة التحقيق أمام الجهاز ليتم تصويرها. في دراستنا، وكان هذا الورم.
- تم تحويل الليزر لإلقاء الضوء على الورم ومعرفة مضان في الشعيرات الدموية.
- وكان استطلاع الورم يدويا عن طريق تحريك التحقيق في حركة بطيئة جدا في حين تم تسجيل لتصور شبكة الشعرية. فمن المهم للحفاظ على مطرد من ناحية، وهذه التقنية تتطلب خبرة قليلة. في دراستنا، هذه الخطوة الأولى يسمح الكمي لكثافة الشعيرات الدموية وظيفية.
- كانت الخطوة الثانية اكتساب ديناميكية مع مرور الوقت. لهذه الدراسة، استخدمنا 70 كيلو دالتون FITC-ديكستران. لا يوجد أي تسرب الخلالي في معظم الأجهزة العادية ولكن هناك في الأورام. للحصول على الصور من نفس الموقع أكثر من مرة (كما في حالتنا)، فمن المهم لاقامة نظام للحفاظ على التحقيق في مجال الاهتمام. وقد تم ذلك باستخدام الدعم اليدوية لعقد لجنة التحقيق، ووضع قليلا من الجل الموجات فوق الصوتية على غيض من التحقيق. قبل التسجيل، وأمضى بعض الوقت لتحقيق الاستقرار في لجنة التحقيق وضعت في اتصال مع الورم. مرة واحدة تم تأمين الموقف، لم يكن هناك سوى الحد الأدنى من الحركة بسبب التنفس الفأر. تم تحويل الليزر على تسجيل 3 صور كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة للكشف عن وجود تسرب الشعرية. تم إيقاف تشغيله بين كل تسجيل للحد من التباين وكيل التبييض.
- في تجربتنا، تم التضحية الفئران في نهاية الإجراء للتحليل النسيجي للأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام البيانات التي تم جمعها، ونحن يمكن تحليل كمي معلمات مختلفة تعكس دوران الأوعية الدقيقة.
درسنا في الجسم الحي على شبكة الأوعية الدموية الطرفية وجود ورم القولون زرعها في الفئران BALB ج باستخدام نظام متحد البؤر مضان videomicroscopy فيبيريد (Cellvizio، Maunakea التكنولوجيا، باريس، فرنسا 2)، بعد حقن عامل تباين الفلورسنت الجزيئات فلوريسئين ثيوسيانات-ديكستران ( FITC-ديكستران) مع الوزن الجزيئي 70 كيلو دالتون (سيغما الدريخ، سان كوينتين Fallavier، فرنسا) ومع الإثارة وانبعاث موجات من 488 نانومتر و 520 نانومتر على التوالي (من أجل التوافق مع نظام التصوير لدينا).
كانت الخطوة الأولى في تجربتنا لتسجيل 5 أفلام ثانية في كل من الأرباع الأربعة من الورم لتصور شبكة الشعرية. هذه عينة ممثلة يسمح للالأوعية الدموية السرطانية. تم تجهيز جميع الأفلام باستخدام برنامج (ImageCell، ماوناكيا التكنولوجيا، فرنسا باريس) إجراء عملية تجزئة الآلي للسفن في الصور حول اختيار قطر (10 ميكرومتر في حالتنا، والتي شملت السفن التي تتراوح 5-20 ميكرون في القطر). وبالتالي، فإننا لا يمكن قياس "الكثافة الشعرية الفنية" (FCD)، والذي هو النسبة بين منطقة السفينة ومجموع المساحة الكلية للصورة. وكان هذا علامة المعلمة البديلة من كثافة الاوعية الدموية الدقيقة، وعادة ما تقاس باستخدام أدوات علم الأمراض. يبين الشكل 1 مثالا على نوع من الصور التي تم الحصول عليها ونتيجة لسفينة تجزئة. في هذا المثال، تم قياس FCD كما 36٪.
ثم، تم تسجيل ثلاث صور كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة للكشف عن وجود تسرب الشعرية. تم إجراء الفحص البصري للصور الأولى، لتقييم غياب أو وجود تسرب عامل تباين في النسيج الخلالي، فضلا عن توزيعها المكاني (متجانسة أو غير متجانسة).
وضعنا ثلاث مناطق من كثافة العمليات erest (ROI) في الشعيرات الدموية وثلاثة العائد على الاستثمار في النسيج الخلالي في نقاط زمنية 0، 5، 10 و 20 دقيقة. وبلغ متوسط شدة الإشارة (SI) داخل الشعيرات الدموية الثلاثة المختلفة والمناطق الخلالي متجاورة في كل نقطة زمنية. تم حساب مؤشر التسرب (٪) على النحو التالي = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] × 100/3 حيث ايب هو حول الوعاء (أو الخلالي) شدة والثاني هو كثافة داخل الأوعية الدموية 5 -7. ويبين الشكل 2 مثالا من تسرب عامل تباين في النسيج الخلالي. في هذا المثال، تم قياس تسرب المؤشر بعد 1.47.
هذه التقنية التصوير الضوئي محسنة تباين ديناميكية تسمح في القياسات المجراة من الورم دوران الأوعية الدقيقة. أنه يعكس بنية الأوعية الورم عن طريق قياس الكثافة الشعرية، وظائفها عن طريق قياس نفاذية الشعيرات الدموية.
ز "/>
الشكل 1. اليسار: صورة لmicrovessels في الطبقة السطحية للورم اليمين: تطبيق وحدة الكشف السفينة إلى السفن تلقائيا الجزء مع بأقطار تتراوح ما 5-20 ميكرون (قطر الفائدة: 10 ميكرون). ويسلط الضوء على الأوعية مجزأة باللون الأرجواني.
الشكل 2. وينظر تسرب من الشعيرات الدموية إلى النسيج الخلالي في نقاط زمنية مختلفة، على التوالي ر 0 (أ)، ر 5 (ب)، ر 10 (ج) و 20 ر (د). السفن (V) هياكل خطية إشارة عالية. قبل الحقن (ر 0)، وينظر أي إشارة في النسيج الخلالي (I). تدريجيا، يمكن أن ينظر إلى تعزيز في النسيج الخلالي بسبب تسرب من وكيل النقيض الفلورسنت من خلال حاجز غير طبيعي الورم البطاني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبحت دراسة الورم دوران الأوعية الدقيقة الأساسية في فهم الفيزيولوجيا المرضية لنمو الورم ونشرها وردا على العلاج 1. التصوير الضوئي هو واحد من التقنيات التي يمكن استخدامها لمراقبة الشعيرات الدموية باستخدام عامل تباين الفلورسنت والمورفولوجية لقياس (الكثافة الشعرية وظيفية) والوظيفية (التسرب مؤشر) معلمات.
التصوير المجهري مضان استخدمنا في هذه الدراسة على حد سواء مزايا وحدود. ميزة واحدة هي أن تكون قادرة على اختيار حجم وكيل النقيض المستخدمة. هنا، مع 70 كيلو دالتون FITC-ديكستران، وكان التسرب من خلال حاجز غشائي في بداية التجربة الحد الأدنى، الأمر الذي سمح لنا لمراقبة التشكل الأولي (تعرج، شبكة الفوضوية، الخ.) من السفن مع النقيض جيدة بين السفن والنسيج الخلالي 8، وبعد تأخير، والتسرب من وكيل النقيض من أكثر من 20 دقيقة من المراقبة. لفي الطائرة (خكان ذ) عالية الدقة (3.5 ميكرون)، الأمر الذي سمح لنا لتصور السفن والنسيج الخلالي على المستوى المجهري، بدلا من مستوى العيانية كما هو الحال مع معظم تقنيات التصوير الأخرى (MRI، CT، الموجات فوق الصوتية، PET ...). أخيرا، وهذا هو التصوير في الوقت الحقيقي، مما يعني أن التغيرات يمكن ملاحظتها عند حدوثها.
ومع ذلك، هناك عيوب لهذه التقنية. جهاز حساس للعمل. في الواقع، والتحقيق هو صغير جدا (1.8 ملم) وزلق وأنه من الصعب البقاء في نفس المكان على الورم على مدى فترات طويلة من الزمن. حركات التنفس الحيوان أيضا تنازلات الثبات. لتحسين هذا، كنا هلام الموجات فوق الصوتية للشل التحقيق والدعم اليدوية للحفاظ على التحقيق في الموقف. وعلاوة على ذلك، يمكننا فقط استكشاف المنطقة السطحية للورم (من 100 ميكرون إلى 170 ميكرون)، وهو ما يعني أن النتائج التي تم الحصول عليها لا تخص سوى الطبقات الأكثر سطحية من الورم.
الحد الرئيسية، howeveص، هو صعوبة في الوصول الكمي المطلق باستخدام التصوير الضوئي. تسرب المؤشر هو نسبة، وبالتالي معلمة فقط نصف الكمية. أولا، هناك القطع الأثرية بسبب التحجيم جزئية في العائد على الاستثمار. في الواقع، على الرغم من أن القرار في الطائرة عالية، والقرار ض الطائرة منخفضة (سمك شريحة من 70 ميكرون)، مما يعني أنه يشمل كلا من السفن والنسيج الخلالي. لذلك، عند قياس كثافة إشارة في وعاء بقطر 10 ميكرون، وبلغ متوسط مع الخلالي المحيطة تضمينها في شريحة. أيضا، في مجال التصوير الضوئي، وهناك علاقة معقدة بين كثافة إشارة وتركيز وكيل التباين. عندما يضيء الأنسجة بواسطة الفوتونات، قد تحدث العديد من الأحداث في وقت واحد والتأثير في إشارة جمعها. هناك حاملات الألوان الطبيعية في الأنسجة التي يمكن أن تمتص الإثارة أو انبعاث الفوتونات مثل الهيموجلوبين أو الكولاجين. وهناك أيضا بعض الانتشار الذي يشتت الفوتونات في عدة اتجاهات. أخيرا، وتبيض هو على الارجح واحدةمن أهم القضايا عند استخدام FITC، لأنه يؤدي الى فقدان إشارة مستقلة عن التركيز. وعدة مجموعات بحثية تعمل على قياس الإشارات الضوئية ولكن هذا ينطوي على modelization 9،10 المعقدة.
أخيرا، لا يتم إجراء دراسات طولية بسهولة. كان علينا أن شق الجلد للكشف عن الورم من أجل الحصول على الصور، وأنه قد يكون من الصعب قرب شق، لا سيما عندما يكون الجهاز وحظ عميقة في تجويف الجسم (مثل الكبد أو الكلى).
عموما، قمنا بتطوير مضان محسنة النقيض تقنية التصوير الضوئي الديناميكي لوصف كميا التشريح الشعرية وظيفة، وذلك باستخدام جهاز مضان videomicroscopy متحد البؤر. هذا الأسلوب يتطلب مزيدا من التحقق من صحة، ولكن قد يكون من المفيد لمقارنة ورم الأوعية الدموية قبل وبعد العلاج، أو بين النماذج الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
