Summary
In questo articolo, vi presentiamo un metodo per analizzare microvasi tumorali in vivo utilizzando dinamico con mdc fluorescenza videomicroscopia. Due parametri quantitativi sono stati acquisiti: densità capillare funzionale che riflette la vascolarizzazione del tumore, e perdite indice che riflette la permeabilità della parete endoteliale.
Abstract
Fibered confocale a fluorescenza imaging in vivo con un fascio di fibre ottiche utilizza lo stesso principio microscopia confocale a fluorescenza. Si può eccitare fluorescente in situ elementi attraverso le fibre ottiche, e quindi registrare alcuni dei fotoni emessi, tramite le stesse fibre ottiche. La sorgente luminosa è un laser che invia la luce eccitante attraverso un elemento all'interno del fascio di fibre e durante la scansione sul campione, ricrea l'immagine pixel per pixel. Poiché questa scansione è molto veloce, combinandolo con un software di elaborazione delle immagini dedicato, le immagini in tempo reale con una frequenza di 12 fotogrammi / sec possono essere ottenuti.
Abbiamo sviluppato una tecnica per caratterizzare quantitativamente la morfologia e la funzione capillare, utilizzando un dispositivo di fluorescenza videomicroscopia confocale. Il primo passo nel nostro esperimento era di registrare film 5 sec nei quattro quadranti del tumore per visualizzare la rete capillare. Tutti i film sono stati elaborati utilizzando il software (ImageCell, Mauna Kea Tecnologia, Parigi, Francia) che esegue una segmentazione automatica delle navi intorno ad un diametro scelto (10 micron nel nostro caso). Quindi, potremmo quantificare la 'densità capillare funzionale', che è il rapporto tra l'area totale del vaso e la superficie totale dell'immagine. Questo parametro è stato un marker surrogato per la densità microvascolare, di solito misurata utilizzando strumenti di patologia.
Il secondo passo è stato quello di registrare filmati del tumore oltre 20 min per quantificare fuoriuscita del mezzo di contrasto macromolecolare attraverso la parete capillare nell'interstizio. Misurando il rapporto di intensità di segnale nell'interstizio oltre che nei vasi, un 'indice di dispersione' stato ottenuto, agendo come marker surrogato permeabilità capillare.
Introduction
L'angiogenesi è un processo complesso 1 che comporta la formazione di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti. Alterazioni patologiche microcircolazione del tessuto, composto da arteriole, capillari e venule, sono implicati in una vasta gamma di malattie come il cancro, infiammazione, o diabete. E 'quindi essenziale per sviluppare metodi per valutare quantitativamente la struttura e la funzione microvascolare. Imaging consente lo studio di microvasi in un non-o micro-invasiva modo, in tempo reale e in vivo, e misure ripetute nel tempo nello stesso animale 2.
Attualmente, dinamico con mdc (DCE) di imaging 3 è comunemente utilizzato per valutare la microcircolazione dei tessuti. L'imaging mdc dinamico è una tecnica che segue nel tempo la biodistribuzione di un tracciante iniettato per via endovenosa. Da questa acquisizione, parametri quantitativi possono essere estratti riflettente vascolarizzazione dei tessuti. Immagini DCEè stato più spesso utilizzato con la TAC, risonanza magnetica o ecografia. Tuttavia, queste tecniche di imaging non consentono la visualizzazione diretta dei microvasi, poiché la loro risoluzione, se non con l'uso di specifici dispositivi sperimentali, spesso rimane macroscopico.
In questo lavoro, ci proponiamo di studiare il sistema vascolare del tumore alla scala microscopica e in vivo utilizzando imaging ottico dinamico contrast-enhanced, con fibrata videomicroscopia confocale. Abbiamo utilizzato un agente di contrasto macromolecolare (FITC-destrano) che rimane esclusivamente all'interno navi o perdite attraverso la barriera endoteliale nell'interstizio, in base al suo peso molecolare e le caratteristiche dell'endotelio del tessuto studiato 4. Questo ha permesso lo studio di entrambi struttura microvasi, delineando correttamente navi, e la permeabilità capillare, da perdite e accumulando nell'interstizio.
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Protocol
1. Preparazione del mezzo di contrasto
- Per FITC-destrano 70 kDa, la dose iniettata è di 500 mg / kg (10 mg di FITC-destrano diluito in 0,1 ml di soluzione fisiologica per un mouse pesatura 20 g).
- L'agente non deve essere esposto a luce troppo lungo. Per evitare sbianca, si raccomanda di coprire il tubo con un foglio di alluminio.
2. Anestesia
- I topi sono stati anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di una miscela 1:4 di xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Francia) e ketamina (ketamina 500, Virbac, Carros, Francia), rispettivamente 66 mg / kg e 264 mg / kg per un 20 g mouse.
3. Preparazione del Organo d'interesse
- Abbiamo rasato i topi nella posizione di interesse (ad esempio, nel corso di un tumore sottocutaneo). Peli di animali è spesso auto-fluorescente quando bianco. Quando nero, assorbe la luce.
- La pelle rivolta verso l'organo ad essere ripreso è stato inciso. E 'importante attendere l'bleeding è fermato prima di iniettare il mezzo di contrasto, altrimenti colerà nel sangue e contaminare l'immagine.
4. Acquisizione
- L'agente di contrasto è stato iniettato attraverso sia la vena giugulare o la vena caudale. Nessuna o poca segnale di fondo c'è nell'organo osservata in assenza di un agente di contrasto fluorescente.
- La sonda è stata posta di fronte dell'organo da acquisire. Nel nostro studio, questo era il tumore.
- Il laser è stato acceso per illuminare il tumore e vedere la fluorescenza nei capillari.
- Il tumore è stato esplorato manualmente spostando la sonda in un movimento molto lento durante la registrazione di visualizzare la rete capillare. È importante mantenere una mano ferma, e questa tecnica richiede un minimo di esperienza. Nel nostro studio, questo primo passo consentita la quantificazione della densità capillare funzionale.
- Il secondo passo è stato l'acquisizione dinamica nel tempo. Per questo studio, abbiamo utilizzato 70 kDa FITC-destrano. Non vi siano perdite interstiziale in maggior parte degli organi normali ma c'è nei tumori. Per acquisire immagini della stessa posizione nel tempo (come nel nostro caso), è importante creare un sistema per mantenere la sonda sulla zona di interesse. Ciò è stato fatto utilizzando un supporto a mano per tenere la sonda, e ponendo un po 'di gel ultrasuoni sulla punta della sonda. Prima della registrazione, il tempo è stato speso per stabilizzare la sonda posta a contatto con il tumore. Una volta che la posizione è stata assicurata, c'era solo il movimento minimo dovuto alla respirazione del mouse. Il laser è acceso per registrare 3 immagini ogni 30 sec per 20 min per rilevare la presenza di perdite capillare. Si è spento tra ogni registrazione per ridurre il contrasto agente sbiancante.
- Nel nostro esperimento, i topi sono stati sacrificati al termine della procedura di analisi istologica dei tumori.
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Representative Results
Utilizzando i dati raccolti, potremmo analizzare quantitativamente diversi parametri che riflettono la microcircolazione.
Abbiamo studiato in vivo la rete vascolare periferico di un tumore al colon impiantato nei topi BALB-c utilizzando un sistema di fluorescenza confocale videomicroscopia fibered (Cellvizio, Maunakea Tecnologia, Paris, France 2), dopo l'iniezione di un mezzo di contrasto fluorescente macromolecolare fluoresceina isotiocianato-destrano ( FITC-destrano) con un peso molecolare di 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) e con eccitazione e di emissione di 488 nm e 520 nm rispettivamente (per la compatibilità con il nostro sistema di imaging).
Il primo passo nel nostro esperimento era di registrare film 5 sec in ciascuno dei quattro quadranti del tumore per visualizzare la rete capillare. Questo campionamento rappresentativo consentita la vascolarizzazione del tumore. Tutti i film sono stati elaborati utilizzando un software (ImageCell, MaunaKea Tecnologia, Parigi Francia) eseguire una segmentazione automatica delle navi nelle immagini intorno ad un diametro scelto (10 micron nel nostro caso, che comprendeva navi che vanno 5-20 micron di diametro). Quindi, potremmo quantificare la 'densità capillare funzionale' (FCD), che è il rapporto tra l'area totale del vaso e la superficie totale dell'immagine. Questo parametro è un marker surrogato di densità microvascolare, solitamente misurato utilizzando strumenti di patologia. Figura 1 mostra un esempio del tipo di immagini ottenute e il risultato della segmentazione nave. In questo esempio, FCD è stata misurata come 36%.
Poi, tre immagini sono state registrate ogni 30 sec per 20 min per rilevare la presenza di perdite capillare. Esame visivo delle immagini è stata eseguita prima, per valutare l'assenza o la presenza di perdite di contrasto agente nell'interstizio nonché la sua distribuzione spaziale (omogeneo o eterogeneo).
Abbiamo pareggiato tre regioni di int erest (ROI) nei capillari e tre ROI nell'interstizio in momenti 0, 5, 10 e 20 min. Le intensità di segnale (SI) entro i tre diversi capillari e le aree interstiziali contigue sono stati mediati in ogni punto. Perdite Index (%) è stata calcolata come segue = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, dove Ip è perivascolare (o interstiziale) intensità e Ii è l'intensità intravascolare 5 -7. Figura 2 mostra un esempio di contrasto dispersione dell'agente nell'interstizio. In questo esempio, indice di dispersione è stata misurata come 1.47.
Questa tecnica di imaging ottico con mdc dinamico consente misure in vivo di tumori microcircolazione. Esso riflette l'architettura dei vasi tumorali quantificando densità capillare, e la loro funzionalità quantificando permeabilità capillare.
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Figura 1. A sinistra:. Immagine di microvasi nello strato superficiale del tumore destra: l'applicazione del modulo di rilevamento delle navi automaticamente navi segmento con diametri 5-20 micron (diametro di interesse: 10 micron). I vasi segmentati sono evidenziati in viola.
Figura 2. Perdite dai capillari al interstizio a tempi diversi, rispettivamente t 0 (a), t 5 (b), t 10 (c) e t 20 (d). Vasi (V) sono considerati strutture lineari come segnale alto. Prima dell'iniezione (t 0), nessun segnale è visto nell'interstizio (I). Progressivamente, un miglioramento può essere visto nell'interstizio causa di una perdita del mezzo di contrasto fluorescente attraverso la barriera anormale tumore endoteliale.
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Discussion
Lo studio del microcircolo tumore è diventato essenziale nella comprensione della fisiopatologia della crescita del tumore, la diffusione e la risposta alla terapia 1. Imaging ottico è una delle tecniche che possono essere utilizzate per osservare i capillari utilizzando un agente di contrasto fluorescente e quantificare morfologica (densità capillare funzionale) e parametri funzionali (indice di dispersione).
La microscopia a fluorescenza che abbiamo usato in questo studio presenta sia vantaggi e limiti. Un vantaggio è quello di poter scegliere la dimensione del mezzo di contrasto utilizzato. Qui, con un 70-kDa FITC-destrano, perdite attraverso la barriera endoteliale all'inizio dell'esperimento era minimo, che ci ha permesso di osservare la morfologia iniziale (tortuosità, la rete anarchica, ecc.) Delle navi con un buon contrasto tra vasi e interstizio 8, e dopo un ritardo, una perdita del mezzo di contrasto oltre 20 min di osservazione. La nel piano (xy) risoluzione è elevata (3,5 micron), che ci ha permesso di visualizzare i vasi e interstizio a livello microscopico, invece di un livello macroscopico come la maggior parte altre tecniche di imaging (MRI, CT, ultrasuoni, PET ...). Infine, questa è l'imaging in tempo reale, il che significa che i cambiamenti possono essere osservati quando si verificano.
Tuttavia, ci sono svantaggi a questa tecnica. L'apparato è delicato per funzionare. Infatti, la sonda è molto piccolo (1,8 mm) e scivoloso ed è difficile rimanere nella stessa posizione del tumore per lunghi periodi di tempo. Movimenti respiratori dell'animale anche compromettere stabilità. Per migliorare questo, abbiamo usato gel ultrasuoni per immobilizzare la sonda ed un supporto a mano per mantenere la sonda in posizione. Inoltre, possiamo esplorare solo l'area superficiale del tumore (da 100 micron a 170 micron), il che significa che i risultati ottenuti riguardano solo gli strati più superficiali del tumore.
Il limite principale, however, è la difficoltà nel raggiungere la quantificazione assoluta mediante imaging ottico. Indice di dispersione è un rapporto, e quindi solo un parametro semiquantitativo. Primo, vi sono artefatti dovuti a voluming parziale nel ROI. Infatti, se la risoluzione in piano è alta, la risoluzione piano z è bassa (spessore di strato di 70 micron), che significa che si tratta sia vasi e interstizio. Pertanto, quando si misura l'intensità del segnale in un recipiente con un diametro di 10 micron, è in media con l'interstizio circostante inclusa nella fetta. Inoltre, in imaging ottico, vi è un rapporto complesso tra l'intensità del segnale e la concentrazione dell'agente di contrasto. Quando un tessuto è illuminato da fotoni, molti eventi possono verificarsi simultaneamente e influenzare il segnale raccolto. Ci sono cromofori naturali nei tessuti che possono assorbire eccitazione o di emissione di fotoni come l'emoglobina o collagene. C'è anche una certa diffusione che disperde fotoni in più direzioni. Infine, sbianca è probabilmente unadei problemi più importanti quando si utilizza FITC, perché induce una perdita di segnale indipendente dalla concentrazione. Diversi gruppi di ricerca stanno lavorando sulla quantificazione del segnale ottico, ma questo implica una complessa modellizzazione 9,10.
Infine, studi longitudinali non sono facilmente eseguite. Abbiamo dovuto incidere la pelle per rivelare il tumore, al fine di acquisire le immagini e può risultare difficile chiudere l'incisione, in particolare quando l'organo osservata è profondo nella cavità del corpo (ad esempio il fegato o renali).
Nel complesso, abbiamo sviluppato una fluorescenza con mdc tecnica di imaging ottico dinamico per caratterizzare quantitativamente anatomia e la funzione capillare, utilizzando un dispositivo di fluorescenza videomicroscopia confocale. Questa tecnica richiede ulteriore convalida, ma può essere utile per confrontare vascolarizzazione tumorale prima e dopo la terapia, o tra modelli tumorali.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
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- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
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