Summary
I dette papir, præsenterer vi en metode til at analysere tumor mikrokar in vivo ved hjælp af dynamisk kontrast-forstærkede fluorescens videomicroscopy. To kvantitative parametre blev erhvervet: funktionel kapillartæthed afspejler vaskularisering af tumoren, og indeks lækage afspejler utætheder af endotel væg.
Abstract
Fibered konfokal fluorescens in vivo billeddannelse med en fiberoptisk bundt anvender samme princip som fluorescerende konfokal mikroskopi. Det kan vække fluorescerende in situ elementer gennem de optiske fibre, og derefter optage nogle af de udsendte fotoner, via de samme optiske fibre. Lyskilden er en laser, der sender det exciterende lys gennem et element i fiberbundtet og som det scanner over prøven, genskaber et billede pixel for pixel. Da denne scanning er meget hurtigt, ved at kombinere det med dedikeret billedbehandling software, kan billeder i realtid med en frekvens på 12 billeder / sek opnås.
Vi har udviklet en teknik til kvantitativt karakterisere kapillær morfologi og funktion, ved hjælp af en konfokal fluorescens videomicroscopy enhed. Det første skridt i vores forsøg var at optage 5 sec film i de fire kvadranter af tumor for at visualisere det kapillære netværk. Alle film blev behandlet ved hjælp af software (jegmageCell, Mauna Kea Technology, Paris Frankrig), der udfører en automatiseret segmentering af skibe omkring en udvalgt diameter (10 um i vores tilfælde). Således kunne vi kvantificere »funktionel kapillartæthed", som er forholdet mellem det samlede skib areal og det samlede areal af billedet. Denne parameter var et surrogat markør for mikrovaskulære tæthed, som regel målt ved hjælp af patologi værktøjer.
Andet skridt var at optage film af tumoren over 20 minutter at kvantificere lækage af den makromolekylære kontraststof gennem kapillærvæggen ind interstitium. Ved at måle forholdet mellem signal intensitet i interstitium over det i skibene blev et 'indeks udsivning "opnået, som et surrogat markør for kapillarpermeabilitet.
Introduction
Angiogenese er en kompleks proces 1, som involverer dannelsen af nye blodkar fra præ-eksisterende fartøjer. Patologiske forandringer i væv mikrocirkulationen, der består af arterioler, kapillærer og venuler, er impliceret i en lang række sygdomme, såsom cancer, inflammation eller diabetes. Det er derfor vigtigt at udvikle metoder til kvantitativ vurdering mikrokardannelse struktur og funktion. Imaging muliggør studiet af mikrokar i en ikke-eller mikro-invasiv måde, i real-tid og in vivo, og gentagne målinger over tid i det samme dyr 2..
I øjeblikket er dynamisk kontrast-forstærket (DCE) billeddannelse 3 almindeligt anvendt til at vurdere væv mikrocirkulationen. Dynamisk kontrast-forstærkede billeddannelse er en teknik, som følger med tiden biofordelingen af et sporstof injiceres intravenøst. Fra denne overtagelse, kan kvantitative parametre udvindes reflekterende væv vaskularisering. DCE imaginghar været oftest bruges med CT, MR eller ultralyd. Men disse billeddiagnostiske teknikker ikke tillader direkte visning af mikrokar, da deres opløsning, andet end med brug af specifikke eksperimentelle enheder, oftest forbliver makroskopisk.
I dette papir, foreslår vi at studere tumorvaskulaturen på mikroskopisk skala og in vivo ved hjælp af dynamisk kontrast-forstærkede optisk billeddannelse, med fibered konfokal videomicroscopy. Vi brugte en makromolekylær kontraststof (FITC-dextran), som fortsat udelukkende inden for skibe eller utætheder gennem endotel barriere i interstitium ifølge sin molekylvægt og de særlige kendetegn ved endotel af vævet studerede 4.. Dette gav undersøgelse af både mikrokardannelse struktur, ved korrekt at afgrænse fartøjer, og kapillærpermeabilitet ved utætte og akkumulere i interstitium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse af kontrastmidlet
- For FITC-dextran 70 kDa, den injicerede dosis er 500 mg / kg (10 mg af FITC-dextran-fortyndet i 0,1 ml saltvand til en mus, der vejer 20 g).
- Agenten skal ikke udsættes for længe for lys. For at undgå blegning, anbefales det at dække røret med aluminiumsfolie.
2. Anæstesi
- Mus blev bedøvet med en intraperitoneal injektion af en blanding på 1:4 af xylazin (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankrig) og ketamin (ketamin 500, Virbac, Carros, Frankrig) henholdsvis 66 mg / kg og 264 mg / kg for en 20 g mus.
3. Forberedelse af Organ of Interest
- Vi barberede mus ved placeringen af interesse (for eksempel over en subkutan tumor). Dyrehår er ofte auto-fluorescerende når hvid. Når sort, det absorberer lys.
- Vender mod huden, det organ, der skal afbildes blev indsnit. Det er vigtigt at vente, indtil bleeding er stoppet før injektion kontrastmidlet, ellers vil lække i blodet og forurene billedet.
4.. Erhvervelse
- Kontrastmidlet blev injiceret enten gennem halsvenen eller den kaudale vene. Der er ingen eller ringe baggrund signal i organet observeret i fravær af et fluorescerende kontrastmiddel.
- Sonden blev anbragt foran det organ, der skal afbildes. I vores undersøgelse, var tumoren.
- Laseren blev tændt for at belyse tumor og se fluorescens i kapillærerne.
- Den tumor blev udforsket manuelt ved at flytte sonden i en meget langsom bevægelse, mens du optager at visualisere det kapillære netværk. Det er vigtigt at opretholde en stabil hånd, og denne teknik kræver lidt erfaring. I vores undersøgelse dette første trin tillades kvantificering af funktionelle kapillartæthed.
- Andet skridt var den dynamiske erhvervelse over tid. Til denne undersøgelse anvendte vi et 70 kDa FITC-dextran. Der er ingen interstitiel lækage i de fleste normale organer, men der er i tumorer. At erhverve billeder af den samme placering over tid (som i vores tilfælde), er det vigtigt at etablere et system til at opretholde sonden på det område af interesse. Dette blev gjort ved hjælp af en håndlavet støtte til at holde sonden, og ved at placere en smule ultralyd gel på spidsen af sonden. Før optagelse blev tid til at stabilisere sonden placeret i kontakt med tumoren. Når positionen blev sikret, var der kun minimal bevægelse på grund af musens vejrtrækning. Laseren blev tændt for at optage 3 billeder hver 30 sek 20 min til at påvise tilstedeværelsen af kapillær lækage. Det var slukket mellem hver optagelse for at reducere kontraststof blegning.
- I vores forsøg blev mus aflivet ved afslutningen af proceduren for histologisk analyse af tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af de indsamlede data, kan vi kvantitativt analysere forskellige parametre, der afspejler mikrocirkulationen.
Vi undersøgte in vivo perifere vaskulære netværk af et kolon tumor implanteret i BALB-c mus ved hjælp af en fibered konfokal fluorescens videomicroscopy systemet (Cellvizio, Maunakea Technology, Paris, Frankrig 2), efter injektion af en makromolekylær fluorescerende kontrastmiddel fluoresceinisothiocyanat-dextran ( FITC-dextran) med en molekylvægt på 70 kDa (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig) og med excitations-og emissions-bølgelængder på 488 nm og 520 nm (for kompatibilitet med vores imaging system).
Det første skridt i vores forsøg var at optage 5 sec film i hver af de fire kvadranter af tumoren for at visualisere det kapillære netværk. Dette gav repræsentativ prøvetagning af tumorvaskularisering. Alle film blev behandlet ved hjælp af en software (ImageCell, MaunaKea Technology, Paris Frankrig) udfører en automatiseret segmentering af skibe i billeder omkring et valgt diameter (10 um i vores tilfælde, som omfattede fartøjer, der spænder fra 5 til 20 um i diameter). Således kunne vi kvantificere »funktionel kapillartæthed (FCD), som er forholdet mellem det samlede skib areal og det samlede areal af billedet. Denne parameter var et surrogat markør for mikrovaskulære tæthed, som regel målt ved hjælp af patologi værktøjer. Figur 1 viser et eksempel på den type billeder opnået, og resultatet af segmentering fartøj. I dette eksempel blev FCD målt som 36%.
Derefter blev tre billeder optaget hver 30 sek i 20 minutter for at detektere tilstedeværelsen af kapillær lækage. Visuel undersøgelse af billederne blev uropført, at vurdere fraværet eller tilstedeværelsen af kontrastmiddel lækage i interstitium såvel som dens rumlige fordeling (homogen eller heterogen).
Vi trak tre regioner i int påløbne (ROI) i kapillærer og tre ROI i interstitium på tidspunkter 0, 5, 10 og 20 min. Signalintensiteter (SI) inden for de tre forskellige kapillærer og sammenhængende interstitielle områder blev gennemsnit på hvert tidspunkt. Index lækage (%) blev beregnet som følger = Σ [(Ip1/Ii1) + (Ip2/Ii2) + (Ip3/Ii3)] x 100/3, hvor Ip er perivaskulære (eller interstitiel) intensitet og Ii er intravaskulær intensitet 5 -7. Figur 2 viser et eksempel på kontrastmiddel lækage i interstitium. I dette eksempel blev indeks lækage målt som 1,47.
Denne dynamiske kontrast-forstærkede optisk billeddannelse teknik gør det muligt in vivo målinger af tumor mikrocirkulationen. Det afspejler arkitektur tumorkar ved at kvantificere kapillartæthed, og deres funktionalitet ved at kvantificere kapillarpermeabilitet.
g "/>
Figur 1. Venstre:. Billede af mikrokar i det overfladiske lag af tumor højre: anvendelse af fartøjet afsløring modulet til automatisk at segmentere fartøjer med diametre fra 5 til 20 m (diameter af interesse: 10 pm). De segmenterede skibe er fremhævet med lilla.
Figur 2. Lækage fra kapillærerne til interstitium på forskellige tidspunkter, henholdsvis t 0 (a), t 5 (b) t 10 (c), og t 20 (d). Fartøjer (V) er set så høje signal lineære strukturer. Før injektion (t 0), er intet signal ses i interstitium (I). Gradvist, kan en forbedring ses i interstitium grund af en lækage af det fluorescerende kontrastmiddel gennem unormal tumor endotel barriere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet af tumor mikrocirkulationen er blevet vigtigt i forståelsen af patofysiologien af tumorvækst, formidling og respons på behandling 1. Optisk billeddannelse er en af de teknikker, der kan anvendes til at overholde de kapillærer under anvendelse af et fluorescerende kontrastmiddel og kvantificere morfologiske (Functional Kapillær Density) og funktionelle (indeks lækage) parametre.
Den fluorescens mikroskopi billeddannelse vi brugte i denne undersøgelse har både fordele og begrænsninger. En fordel er at være i stand til at vælge størrelsen af kontrastmidlet anvendes. Her med en 70-kDa FITC-dextran, lækage gennem endotel barriere i starten af forsøget var minimal, som tilladt os at observere den oprindelige morfologi (tortuosity, anarkistiske netværk osv.) Af fartøjerne med en god kontrast mellem skibe og interstitium 8, og efter en forsinkelse, en lækage af kontrastmidlet over 20 min observation. Den in-plane (xy) opløsning var høj (3,5 um), hvilket tillod os at visualisere fartøjer og interstitium på et mikroskopisk niveau, i stedet for et makroskopisk niveau med de fleste andre billeddannende teknikker (MRI, CT, ultralyd, PET ...). Endelig er dette tidstro billeddannelse, hvilket betyder, at der kan iagttages ændringer som de opstår.
Der er imidlertid ulemper ved denne teknik. Apparatet er delikat at betjene. Faktisk proben er meget lille (1,8 mm) og glatte, og det er vanskeligt at forblive på det samme sted på tumoren over lange perioder. Dyrets vejrtrækning bevægelser også kompromittere stabilitet. For at forbedre denne, vi brugte ultralyd gel til immobilisere proben og en håndlavet støtte til at fastholde sonden på plads. Desuden kan vi undersøge kun overfladiske område af tumoren (fra 100 um til 170 um), hvilket betyder, at de opnåede resultater vedrører kun de mest overfladiske lag af tumoren.
Den vigtigste grænse, however, er vanskeligheden ved at nå absolut kvantificering ved hjælp af optisk billeddannelse. Index lækage er et forhold, og derfor kun en semi-kvantitativ parameter. Først er der artefakter på grund af delvis voluming i ROI. Faktisk, skønt i plan opløsning er høj, z-planet opløsning er lav (skive tykkelse 70 um), hvilket betyder, at den omfatter både fartøjer og interstitium. Derfor, når måling signal intensitet i et fartøj med en 10-um i diameter, er den i gennemsnit med det omgivende interstitium indgår i udsnittet. Også i optisk billeddannelse, der er en kompleks forbindelse mellem signalintensitet og koncentration kontrastmiddel. Når et væv belyses af fotoner, kan forekomme samtidigt mange arrangementer og påvirke signalet opsamlet. Der er naturlige kromoforer i væv, der kan absorbere excitation eller emissions fotoner såsom hæmoglobin eller collagen. Der er også nogle diffusion der spreder fotonerne i flere retninger. Endelig blegning er formentlig enaf de vigtigste spørgsmål, når du bruger FITC, fordi det fremkalder et tab af signal uafhængig af koncentrationen. Flere forskergrupper arbejder på at kvantificere det optiske signal, men dette indebærer en kompleks modelization 9,10.
Endelig longitudinelle studier ikke let udføres. Vi måtte incise huden til at afsløre tumor med henblik på at erhverve billederne, og det kan vise sig svært at lukke op snittet, især når orglet observerede er dyb i kroppen hulrum (fx lever eller nyre).
Samlet set har vi udviklet en dynamisk kontrast-forstærket fluorescens optisk imaging teknik til kvantitativt karakterisere kapillær anatomi og funktion, ved hjælp af en konfokal fluorescens videomicroscopy enhed. Denne teknik kræver yderligere validering, men kan være nyttig til at sammenligne tumorvaskularisering før og efter behandling, eller mellem tumormodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Insulin serynge Myjector 1ml 29G |
Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL diluted in saline |
| Fibered confocal videomicroscopy | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Store at 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mosaicing software | MaunaKea Technologies | ||
| Vessel detection software | MaunaKea Technologies |
References
- Folkman, J.
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P.
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C.
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
