En Decellularization metodikk for produksjon av en Natural acellulære Intestinal Matrix

Summary

Artikkelen beskriver en metode for produksjon av en acellulær matriks fra rotte tarm. Avledning av tarm stillaser er viktig for fremtidige anvendelser innen tissue engineering, stamcellebiologi og narkotika testing.

Abstract

Vellykket tissue teknikk involverer kombinasjonen av stillaser med egnede celler in vitro eller in vivo. Stillas kan være syntetisk, naturlig-avledet eller avledet fra vev / organer. Det sistnevnte blir oppnådd ved bruk av en teknikk som kalles decellularization. Decellularization kan innebære en kombinasjon av fysiske, kjemiske og enzymatiske metoder. Målet med denne teknikken er å fjerne alle mobiltelefon spor samtidig opprettholde den makro-og mikro-arkitektur av den opprinnelige vev.

Intestinal tissue engineering har så langt brukt relativt enkle stillaser som ikke gjenskape den komplekse arkitekturen av de innfødte organ. Fokuset i denne artikkelen er å beskrive en effektiv decellularization teknikk for rotte tynntarmen. Isoleringen av tynntarmen, for å sikre opprettholdelsen av en vaskulær forbindelsen er beskrevet. Den kombinasjon av kjemiske og enzymatiske løsninger for å fjerne cellene whilst bevare villus-krypten aksen i luminal aspektet av stillaset er også satt ut. Til slutt, er vurderingen av produsert stillaser for egnede egenskaper diskutert.

Introduction

Tissue engineering (TE) gir et terapeutisk alternativ til organtransplantasjon, omgåelsen saker av immunsuppresjon og organmangel. TE har nylig hatt vellykkede søknader i klinikken, med utskifting av organer som blære ^1, urinrør ² og luftrør, både hos voksne ^3,4 og barn ^5.

Bygge en vev-konstruert organ nødvendig kombinasjonen av et stillas med de riktige cellene. Et stillas, kan fremstilles ved hjelp av naturlig-avledet (f.eks kollagen) og syntetiske (for eksempel poly-L-glykolsyre; PLGA) materialer, eller kan oppnås ved decellularization native organer og vev. Stillas som har vært brukt hittil for intestinal TE har hovedsakelig vært enten decellularized (small intestinal submucosa) eller syntetiske (poly-L-glykolsyre og poly-melkesyre) ^6-13. Disse biomaterialer er svært enkle i både makro-og mikro-arkitektur, somkan ikke være ideelt hvis vev-konstruert tarmen er å være klinisk oversatt. En optimal biomateriale for tarmen bør ha en medfødt vaskulære treet som kan kobles til vertens blodtilførsel, et lagdelt rørveggen med ulike egenskaper for å reflektere de lag av tarmveggen og villus-krypt aksen på luminale side for å hjelpe til med repopulation av epitel stamceller.

Decellularization er en roman metodikk som produserer stillaser ved å fjerne celler fra hele organer samtidig opprettholde sin opprinnelige arkitektur ^14. Dette er å foretrekke fremfor eksisterende stillaser, siden de ikke bare replikere strukturen av organet, men også inneholder kjemiske signaler integrert i den ekstracellulære matriks (ECM) som kan benyttes til cellulær proliferasjon og differensiering. I 2008 en avdød luftrøret ble decellularized ^14, sådd med pasientens egne celler, og transplantert til å erstatte de viktigste venstre bronkie i en ung mann 15, lever ^16,17, og lunge ^18-20 i små og store dyr.

Vi har også tilpasset den samme metode for å produsere et tynntarm decellularized stillaset ^21.. Målet med fremgangsmåten beskrevet heri er å produsere decellularized tarm matriser som opprettholder de makroskopiske egenskaper av det opprinnelige vev slik som blodforsyning, så vel som den mikroskopiske arkitekturen på villus-krypten akse i tarmlumen. Vi tror denne metoden kan til slutt bli vedtatt for andre organer for å forbedre effektiviteten i decellularization.

Protocol

En. Isolering av Rat Tarmen

1. Forbered en 1 L løsning fra fosfat bufret (Sigma, UK) med 1% antibiotika / antimycotic (Sigma, UK) (PBS / AA). Monter peristaltisk pumpe (Masterflex L / S variabel hastighet) med to rør. Kjør 70% etanol (EtOH) gjennom rørene av den peristaltiske pumpe i 15 minutter ved maksimal hastighet, etterfulgt av PBS / AA i ytterligere 15 min.
2. Avlive voksne Sprague-Dawley rotter som veier ca 250-350 g av CO ₂ innånding og halshugging i henhold til lokale retningslinjer dyr og godkjenninger (i Storbritannia, hjemmekontor retningslinjer under Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986).
3. Autoklav de kirurgiske instrumenter før bruk. Spray og tørk av buken på dyret ved hjelp av 70% EtOH.
4. Utfør et xifo-kjønnshår laparotomic snitt på magen for å sikre en klar kirurgiske feltet.
5. Eviscerate tynntarmen på høyre side av dyret på et papirhåndkle sprayet med 70% EtOH. Take seg til kontinuerlig å fukte tarmen med PBS / AA, slik som å unngå dehydrering av vev og denaturering av den ekstracellulære matriks (ECM).
6. Finn den overlegne mesenteric arterie (SMA) som oppstår i en 90 ° vinkel fra aorta mot tarmen. Bruke en 27 G kanyle for å gå inn i SMA fra aorta og raskt trekke nålen for å unngå å rive veggen av karet. Advance plastrøret av kanylen inn i SMA og fest med suturer (Vicryl 5/0).
7. Bekreft kanylering ved å injisere 1 ml PBS / AA. Bruk fjær saks for å incise aorta proksimalt og distalt til SMA, slik som å slippe en kanyle.
8. For å unngå lekkasje av avføring når dissekere ut tykktarmen, plasserer en (Silke 5/0) sutur knute på den proksimale ende av ileocaecale knutepunkt og en ved den distale enden av colon sigmoideum. Deretter kuttes terminal ileum og colon mellom de to knuter og fjerne tykktarmen.
9. Kutt tarmen ved jejuno-duodenal krysset ennd frigjøre tarmen fra noen bindevev forbindelser det måtte ha med magen.
10. Overfør tynntarmen i en petriskål med PBS / AA. Cannulate proksimale delen av tarmen med en plast Pasteur pipette (LSL laboratorie forbruksvarer) og fest den på plass med sting. Skjær pipetten slik at det vil passe Luer-Lok av en 60 ml sprøyte (BD Plastipak). Skylle tarmen lumen 2x med 60 ml PBS / AA for å fjerne avføring og rusk.

2. Decellularization Methodology

1. Koble vaskulær kanyle til en tre-veis stoppekran. Dette vil lette håndteringen, redusere spenningen på det vaskulære treet og tillater fjerning av bobler fra slangen.
2. Begynne deionisert vann (resistivitet 18.2 MΩ / cm) gjennom Masterflex L / S variabel hastighet valsen pumpe ved 0,6 ml / hr. Sikre at ingen bobler innen rør før du kobler med intestinal lumen stoppekran. Noen bobler kan være tilstede inne i hulrommet fra trinnet1,9, noe som kan svekke decellularization prosessen. Variere hastigheten på pumpen og behandle vevet med pinsett nøye for å sikre at boblene kommer ut av den distale enden. Ikke koble vaskulær kanyle før denne prosessen er ferdig, siden høye hastigheter kan skade vaskulær treet.
3. Overfør apparat til kjølerommet, da det følgende trinn av decellularization blir utført ved 4 ° C. Den lave temperaturen gjør at fjerning av celler mens minimere vev nedbrytning. Plasser petriskål i en beholder som vil samle opp overstrømmende oppløsning. Perfuse begge tarmlumen og det vaskulære treet med avionisert vann (resistivitet 18.2 MΩ / cm) i 24 timer ved 0,6 ml / hr. For den første timen sjekke apparatet regelmessig for å sikre at alle tilkoblinger er sikre, er lekkasje minimal og ingen bobler er tilstede i tarmen.
4. Etter 24 timers behandling med avionisert vann, beveger decellularization anordning utenfor kjølerommet som resten av trinnene erutført i romtemperatur (RT).
5. Vei natriumdeoksycholat (Sigma, UK) for å forberede 300 ml av en 4% oppløsning i deionisert vann. Vei natriumdeoksycholat under en sugevifte, som den er en oral og irriterende for øynene. Bland ved hjelp av en vortex inntil oppløsningen er klar. Oppløsningen kan holdes ved 4 ° C i opp til 1 måned.
6. Endre avionisert løsning til natriumdeoksycholat, sjekk tilkoblingene, fjern eventuelle bobler og perfuse på 0,6 ml / t for 4 timer.
7. Etter at natrium-deoksycholat trinn vask med PBS / AA i 30 min for å unngå interaksjon mellom natrium-deoksycholat og DNase-I.
8. Vei opp deoksyribonuklease-I (DNase-I, Sigma) og forberede 250 ml av en 2000 kU oppløsning i 1 M natriumklorid, pH 7,4. Bland ved hjelp av en vortex inntil oppløsningen er klar. Denne løsningen må tilberedes umiddelbart før bruk og kan ikke lagres.
9. Perfuse med DNase-I i 3 timer ved romtemperatur med en hastighet på 0,6 ml / time.
10. Etter DNase-I trinn, overførestillas til en vev kultur hette og endre plater og instrumenter. Det er foreslått å bruke aseptisk teknikk.
11. Vask med PBS / AA i 30 min for å sikre at alle rester av decellularization løsninger er fjernet. Plasser stillaset i en ny petriskål og overføre til en UV kryss kobling (Spectroline, USA). Kjør to steriliseringssykluser. Oppbevar i 5% PBS / AA og endre løsningen hver 3. dag.

Representative Results

Etter vellykket decellularization (figur 1), bør stillaset har en makroskopisk utseende som ligner på den ene av de innfødte tarmen, men med gjennomskinnelige vegger (figur 2A). Bevaringen av makro arkitektur bør også være tydelig av åpenheten til det vaskulære tre. Når fargestoff injiseres gjennom kanylen SMA, bør det fordele jevnt i hele stillaset og når kapillær treet (figur 2B). Stillaset skal være fri for kjernefysiske og cytoplasmatisk materiale, noe som kan vurderes ved hjelp av en DNA kvantifisering kit og enkel histologisk analyse. Hematoxylin og eosin farging (H & E) skal demonstrere et fravær av kjernekraft og cytoplasmatisk materialet samtidig bevare de små tarm lag (figur 3A). Spesielt bør vedlikehold av villi og krypter på luminale side være tydelig etter scanning elektronmikroskopi (figur 4). Abevaring av ekstracellulære matriks-komponenter slik som kollagen, elastin og glykosaminoglykaner bør også være forventet. For eksempel, Masson er Trikrom flekker viser intakt bindevev i stillaset (Figur 3B).

Figur 1. . Eksperimentell plan Tidslinje av decellularization prosedyre, PBS / AA: fosfat saltvann med antibiotika-antimycotic, NaDeoxy: Sodium deoxycholate, RT: romtemperatur, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Stillas macroscopic karakteristikker. Makroskopisk utseende av rotte tynntarmen etter vellykket decellularization (A). Injeksjon av Rosso Ponceau fargestoff gjennom SMA demonstrerer en intakt vaskulære nettverk (B), SMA: overlegen mesenteric arterie Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. . Histologi H & E (A) og MT (B) flekker indikerer et fravær av cellemateriale med bevaring av bindevev arkitektur, H & E: hematoxylin og eosin, MT: Masson sin Trikrom. Målestokk:. 100 mikrometer Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. . Elektronmikroskopi Scanning elektronmikros indikerer bevart villus-krypten arkitektur i stillaset lumen; Målestokk:. 100 mikrometer Klikk her for å se større bilde .

Discussion

De vanskeligste skritt i å sette opp dette eksperimentet involvere cannulation av SMA og etablering og vedlikehold av sterilitet. Kanylerør SMA hos gnagere uten sprekker i veggen kan være ganske vanskelig på grunn av størrelsen og posisjonen til fartøyet. Alternativt kan en sutur skal plasseres rundt den proksimale aorta før SMA opprinnelse, etterfulgt av kanylering av aorta seg distalt, dirigere plast kanyle inn i SMA. Under decellularization en kombinasjon av dårlig kanyle plassering og høye strømningshastigheter kan føre til tap av vaskulær tilgang. Sterilitet er et stort problem på grunn av mengden av bakterieflora som er tilstede i tynntarmen. Vask med PBS / AA etter innhøsting er svært viktig, og må fjernes noen tegn til avføring eller rusk fra lumen. Ved å legge en del av stillaset på en falkonrør med DMEM i inkubatoren følgende UV-steriliseringen skal være en indikator om sterilitet er oppnådd. I tilfelletav bakteriell kolonisering, vil mediet endrer pH med sin farge dreie fra rød til gul. For å håndtere dette på, er ytterligere UV-sykluser rådet samt vasking med PBS inneholdende en høy konsentrasjon av antibiotisk / antimykotisk.

En mulig modifikasjon å skaffe et stillas med både vaskulære og venetilgang vil være å cannulate inferior vena cava (IVC), så vel som den SMA. Decellularization fra venøse og vaskulære sider bør forsøkes i perioder for alle tre løsningene. Kontinuerlig decellularization kan sprenge blodkar ved å ha et positivt press på begge sider.

Gjennom årene har det vært en rekke tiltak i tarm TE ved hjelp av ulike celle-stillas kombinasjoner in vitro og in vivo ^6,9,12. Hoveddelen av arbeidet er utført ved hjelp av rørformede vevde 95% PGA-5% PLGA stillasene belagt med kollagen type I ^6,7,13,22. Etter seeding med tarmepiteliale organoid enheter (OUS) og en periode av implantering i omentet hos mus, danner de cyster med muskel på utsiden og epitelet på innsiden som deretter kan tubularized. Imidlertid porøsiteten og enkelhet i utformingen av disse stillaser ikke tillater for generering av store stykker av kunstig tarmen i en in vitro miljø som den om en bioreaktor. I tillegg begrenser mangelen på en medfødt vaskulære nettverk som kan kobles til mottakeren videre bruken av dette stillas for klinisk oversettelse. Foruten de eksperimenter med PGA-PLGA stillasene, har andre grupper brukte kollagen eller SIS stillasene, som begge ikke gjenskape det detaljtarmkanalen. SIS spesielt er den eneste tidligere publiserte metode av tarmvevet teknikk og har vært benyttet i mer enn 150 medisinske innstillinger, som viser evnen til decellularized stillaser for å gi mekanisk stabilitet og fremme cellevekst, mens blying til ingen immunogene respons. Men mangelen på egnede makro-og mikro-arkitektur, har ført til dårlige resultater i sin 'bruk for tarm TE formål ^9-11,23.

Fordelene med decellularization metodikk vi har beskrevet inkludere bevaring av mikroskopiske egenskaper som luminal krypten-villus arkitektur som representerer et passende miljø for repopulation av tarmstamcelle nisje. I den makroskopiske aspekt, vil tilstedeværelsen av en hierarkisk vaskulære nettverk muliggjøre befestigelse til mottakeren, slik at bestemmelsen av næringsstoffer og oksygen til alle lag av TE-tarmen ^21. Hva mer er, har opprettholdelse av ECM-komponenter slik som kollagen, elastin og glyocosaminoglycans en viktig rolle, ikke bare for mekaniske egenskaper, men også å dirigere cellulær proliferasjon og differensiering. Det viktigste er muligheten av decellularization metodikk for å bli skalert opp til storr vev samtidig opprettholde de samme egenskapene er en viktig funksjon for klinisk oversettelse av TE.

Utviklingen av en naturlig tarm matrise med et vaskulære nettverket tillater etablering av større deler av kunstig tarm som kan kobles til verten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol solution, 70% in H20	Sigma	02877
Phosphate buffered saline tablets	Sigma	79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma	A5955
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750	Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	D5025