Summary
يوصف استخدام طريقة حقن الإبر لتطعيم الذرة ونباتات التيوسينت مع مسببات الأمراض النيروبية الحيوية أوستيلاغو مايديس. تسهل طريقة تلقيح حقن الإبر التسليم المراقب لمسببات الأمراض الفطرية بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل الأبريسوريا. هذه الطريقة هي فعالة للغاية، وتمكين التلقيح القابلة للاستنساخ مع U. maydis.
Abstract
الذرة هي محصول الحبوب الرئيسية في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، فإن التعرض لمسببات الأمراض الضوئية هو العائق الرئيسي أمام زيادة الإنتاجية. U. maydis هو مسببات الأمراض الفطرية التروفية الحيوية والعامل السببي لبذاءة الذرة على الذرة. هذا المرض هو المسؤول عن خسائر كبيرة في الغلة من حوالي 1.0 مليار دولار سنويا في الولايات المتحدة1 العديد من الطرق بما في ذلك تناوب المحاصيل، وتطبيق مبيد الفطريات وعلاجات البذور تستخدم حاليا للسيطرة على الذرة smut2. ومع ذلك ، فإن مقاومة المضيف هي الطريقة العملية الوحيدة لإدارة بذيء الذرة. وقد أدى تحديد النباتات المحصولية بما في ذلك الذرة والقمح والأرز المقاومة لمختلف مسببات الأمراض الحيوية إلى انخفاض كبير في خسائر الغلة سنويابنسبة 3-5. ولذلك، فإن استخدام طريقة التطعيم الممرض الذي يسلم بكفاءة واستنساخ الممرض بين أوراق النبات، من شأنه أن يسهل التحديد السريع لخطوط الذرة التي تقاوم ال MAYDIS U. كما, تم استخدام خطوة أولى نحو المسافة البادئة خطوط الذرة التي تقاوم مايديس U., طريقة حقن إبرة التلقيح وطريقة فحص رد فعل المقاومة لتطعيم الذرة, teosinte, والذرة x خطوط الاستبطان teosinte مع سلالة مايوديس U. واختيار النباتات المقاومة.
الذرة، التيوسينتي والذرة x خطوط الاستبطان التيوسينتي، التي تتكون من حوالي 700 نبات، زرعت، تلقيح مع سلالة من المايديس U.، وفحصها للمقاومة. طرق التلقيح والفحص حددت بنجاح ثلاثة خطوط teosinte مقاومة لU. maydis. هنا يتم تقديم حقن إبرة مفصلة بروتوكول فحص رد فعل المقاومة والذرة، التيوسينتي، والذرة x خطوط الاستبطان teosinte. توضح هذه الدراسة أن تلقيح حقن الإبر هو أداة لا تقدر بثمن في الزراعة التي يمكن أن توفر بكفاءة U. maydis بين أوراق النبات وقدمت خطوط نباتية مقاومة لل maydis U. التي يمكن دمجها واختبارها الآن في برامج التربية لتحسين مقاومة الأمراض.
Introduction
الأمراض الفطرية للنباتات تمثل واحدة من أبرز التهديدات للزراعة. وتتزايد الحاجة إلى تطوير محاصيل ذات مقاومة محسنة للأمراض بسبب الاحتياجات الغذائية لسكان العالم المتزايدين. مسببات الأمراض النباتية تصيب بشكل طبيعي النباتات الزراعية في الميدان مما تسبب في الأمراض التي تؤثر سلبا على غلة المحاصيل6. وقد ثبت أن تحديد واستخدام النباتات المقاومة يمكن أن يحسن المقاومة ويقلل من فقدان الغلة. وقد تم تحديد أصناف مقاومة في العديد من الأنواع النباتية بما في ذلك الذرة والقمح والأرز والذرة الرفيعة عن طريق تلقيح النباتات بمسببات الأمراض النباتية واختيار خطوط مقاومة7. ولذلك، فإن تطوير واستخدام طريقة تطعيم فعالة من شأنه أن يسمح بتطعيم العديد من النباتات وفحصها بحثا عن المقاومة. وقد استخدمت أساليب التلقيح المختلفة بما في ذلك انخفاض التطعيم، pipetting ثقافة تعليق الخلية الممرضة في دوامة النبات، والتلقيح حقن إبرة8-11. مع كل طريقة ، يجب إدخال الممرض بشكل موثوق بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل appresoria لضمان تطور مسببات الأمراض والعدوى النباتية12،13.
تتضمن طريقة تلقيح الانخفاض غمر شتلة نباتية في ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض ، في حين أن طريقة الأنابيب تتطلب وضع ثقافة تعليق الخلية المسببة للأمراض في دوامة شتلة النبات. ومع ذلك، هناك مشاكل مع كلا الأسلوبين. أولا ، تعتمد كلتا الطريقتين على الحركة الطبيعية للمسبب الممرض من سطح الورق إلى الأنسجة النباتية التي هي متغيرة للغاية. معظم مسببات الأمراض تدخل بشكل طبيعي النبات من خلال فتحات الفم أو الجروح على سطح ورقة النبات. ومع ذلك ، هناك تباين كبير في قدرة مسببات الأمراض على اختراق سطح ورقة النبات من خلال stomata و / أو الجروح على سطح الورقة. لذلك، لا يمكن التحكم في اختراق مسببات الأمراض مع أي من طريقتي التطعيم التي يحتمل أن تؤدي إلى بيانات غير متسقة. ثانيا، عند فحص عدد كبير من النباتات، يمكن أن يكون غمر الشتلات في ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض مضيعة للوقت وقد يحد من عدد النباتات التي يمكن فحصها. على العكس من ذلك ، فإن بروتوكول حقن الإبر الموصوفة هنا يسلم ثقافة تعليق الخلية المسببة للأمراض بين أوراق النبات التي تسهل تشكيل appressoria14. ثم يستخدم العامل الممرض appressoria المطورة حديثا لدخول المصنع القضاء على مسألة اختراق مسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، يوفر بروتوكول تلقيح حقن الإبر مجموعة من الأنماط الظاهرية لنباتات الذرة والتيوسينت التي تم تلقيحها مع المايديس U. وإظهار عدوى جيدة. يمكن استخدام الأنماط الظاهرية كعلامة لتحديد أفضل تركيز لثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض مما يؤدي إلى أنماط ظاهرة نباتية متسقة داخل التجارب المختلفة وفيما بينها.
بعد تلقيح النبات مع ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض ، يتم فحص النباتات عادة للكشف عن النمط الظاهري المقاوم أو المعرضللإصابة 8-11،15. في حين أن مقاييس تصنيف الأمراض قد استخدمت على نطاق واسع لفحص وتصنيف الأنماط الظاهرية النباتية، تختلف مقاييس التصنيف اعتمادا على العامل الممرض الذي يتم تحليله. لذلك ، يمكن استخدام إنشاء بروتوكول مقياس تصنيف المرض لتفاعلات المايديس والذرة في الكائنات الفطرية المماثلة16.
السلسلة الحالية من البروتوكولات تفاصيل حقن الإبرة التطعيم مع U. maydis تعليق الخلية الثقافة ومقاومة المرض فحص رد فعل الذرة، التيوسينتي، والذرة x خطوط الاستبطان teosinte. ولا تقتصر البروتوكولات الحالية على تلقيح حقن الإبر من المايديس U. في نباتات الذرة ولكن يمكن استخدامها لأي مسببات أمراض فطرية نسبيا والأنواع النباتية. ولذلك، فإن إدراج تفاصيل كلا الأسلوبين في البروتوكول نفسه سيمكن الباحثين من الاستفادة المباشرة من البروتوكولات للتلقيح والفحص أو التلاعب بالبروتوكولات الأصلية لتناسب بشكل أفضل الأنواع الممرضة والنباتية ذات الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو المواد النباتية
- حدد خطوط النبات للتلقيح والفحص. وقد استخدم في هذا العمل خطان للذرة وخمسة خطوط تيوسينتي وأربعين خطا من خطوط الذرة x التيوسينتية ذات المقاومة غير المنقرة ل U. maydis (الجدول 1).
- بذور النبات للتجارب(U. maydis الحقن) والسيطرة (حقن المياه) حقن إبرة التجارب. القيام بذلك لكل خط النبات.
- زرع أربعة بذور (replicates) لكل خط النبات في شقق صغيرة عن طريق دفع البذور حوالي 1/2 بوصة في التربة مع الاصبع وتغطي مع التربة طفيفة (الشكلان 1A و 1B). لا تحزم التربة فوق البذور. زرع البذور أعمق أو التعبئة التربة على البذور قد يسبب مشاكل مع ظهور الشتلات.
- المياه البذور في التربة. تأكد من أن التربة غارقة والبذور تبقى تحت التربة بعد سقي.
- بعد الري، ضع النباتات في غرفة النمو مع بيئات نهارية وليل من درجة حرارة 28/20 درجة مئوية و14/10 ساعة من الفوتوبيريود، على التوالي وحوالي 500 ميكرومول/م2 ثانية إشعاعات نشطة ضوئيا في الجزء العلوي من المظلة. الحفاظ على الرطوبة النسبية خلال النهار والليل في حوالي 70٪ و 90٪، على التوالي.
- الحفاظ على جميع النباتات في غرفة النمو نفسها للحفاظ على بيئة النمو التي هي متطابقة عبر التجربة.
- بعد 10 أيام، وإزالة النباتات من غرفة النمو وتطعيم النباتات مع ثقافة تعليق الخلية U. maydis باستخدام طريقة حقن إبرة التطعيم. ملاحظة: يمكن تلقيح نباتات الذرة بعد 7 أيام منالزراعة 8-10. ومع ذلك ، فإن النباتات التيوسينت صغيرة جدا بعد 7 أيام. ولذلك، تلقيح كل من الذرة والنباتات التيوسينتي بعد 10 أيام من الزراعة من أجل الاتساق داخل التجربة (انظر الخطوة 2-12).
2. حقن الإبرة تلقيح
- القيام بكل عمل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. إزالة مخزونات الجلسرين U. maydis من تخزين الفريزر. استخدام حلقة معقمة ومخزونات الجليسيرول المتتالية من سلالات U. maydis البرية من النوع 1/2 (نوع التزاوج a1b1) و 2/9 (نوع التزاوج a2b2، بالقرب من متساوي المنشأ إلى 1/2) على لوحات البطاطا dextrose أجار (المساعد الشخصي الرقمي). الحفاظ على سلالات بشكل منفصل.
- ضع لوحات المساعد الشخصي الرقمي مع maydis U. في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة يومين. إذا كان استخدام مسببات الأمراض الكائنات الحية مختلفة استخدام سلالة المناسبة، وسائل الإعلام وظروف النمو. رصد نمو الممرض على مدى فترة يومين لضمان أن سلالة مايديس U. ينمو بشكل جيد.
- إزالة لوحات المساعد الشخصي الرقمي من الحاضنة بعد يومين. يجب أن يكون للوحات نمو ممرض جيد وتحتوي على مستعمرات واحدة (الشكل 2A). من المهم الحصول على مستعمرات واحدة. إذا كانت المستعمرات واحدة ليست موجودة rereak لوحات في تركيز أقل.
- القيام بكل العمل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. استخدام مسواك معقمة لتحديد مستعمرة واحدة لكل سلالة من لوحات المساعد الشخصي الرقمي. ضع المسواك التي تحتوي على مستعمرة واحدة في مرق ديكستروز بطاطا 3 مل (PDB). ينصح أن يكون 2-3 الثقافات.
- ضع 3 مل PDB الثقافات في حاضنة 30 درجة مئوية / شاكر لمدة يومين في 200 دورة في الدقيقة. رصد نمو الثقافة على مدى يومين لضمان نمو الثقافة. يجب أن تبدو الثقافة غائمة للغاية.
- إزالة الثقافات السائلة من الحاضنة / شاكر وقياس التركيز في OD600 لضمان أن نمت الخلايا إلى OD من 1.0 (~ 1 × 107 خلايا / مل)17.
- جلب الثقافات تعليق الخلية مايديس U. إلى تركيز النهائي من 1 × 106 خلايا / مل، وذلك باستخدام الماء في حجم 30 مل النهائي الثقافة. هذا التركيز يؤدي باستمرار إلى عدوى جيدة من النباتات مع ثقافة تعليق الخلية الممرضة. 17
ملاحظة: يجب اختبار تركيزات تعليق الخلايا المختلفة عند استخدام سلالات مسببات الأمراض المختلفة لتحديد تأليه الخلية المناسبة اللازمة للتلقيح18،19. يمكن استخدام التركيز النهائي المعطى لثقافة تعليق الخلية كنقطة انطلاق للترتزاز. وينبغي التحقق من التركيز المناسب لثقافة تعليق الخلية الممرضة من خلال تصور الأنماط الظاهرية النباتية مع عدوى جيدة(الأرقام 3A-E).
- مزيج كميات متساوية من اثنين من سلالات مايديس U. قبل التطعيم. إذا كان استخدام سلالة واحدة من مسببات الأمراض المضي قدما إلى الخطوة 2.9. إعداد ثقافات تعليق الخلايا الجديدة في U. maydis لكل تجربة تلقيح وتجاهل ثقافات تعليق الخلايا بعد يومين.
- للتلقيح حقن إبرة التجريبية, ملء حقنة 3 مل مع U. مايديس تعليق الخلية الثقافة عن طريق رسم ثقافة تعليق الخلية في الحقنة.
- للتلقيح حقن إبرة التحكم، وملء حقنة 3 مل بالماء17. استخدم نفس الإجراء للتلقيح التجريبي لحقن الإبر.
- إرفاق إبرة تحت الجلد 0.457 مم × 1.3 سم إلى نهاية كل حقنة 3 مل. حجم الإبرة المحددة سوف يسلم ثقافة تعليق الخلية بين أوراق النبات مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة النباتية.
- إزالة النباتات التجريبية والسيطرة من غرفة النمو بعد 10 أيام من زرع استعدادا للتلقيح حقن الإبر (الشكل 2B) (انظر الخطوة 1.7).
- أدخل بعناية إبرة تحت الجلد التي تحتوي على ثقافة تعليق الخلية U. maydis في جذع نبات تجريبي بزاوية 90 درجة فوق خط التربة مباشرة. أدخل الإبرة حتى تكون في منتصف الساق. لا تدفع الإبرة من خلال الجذعية (الشكل 2C).
- حقن النبات التجريبي مع حوالي 100 ميكرولتر من U. مايديس تعليق الخلية الثقافة18,19. وهذا سوف تختلف قليلا اعتمادا على ارتفاع الشتلات. سوف تدفع ثقافة تعليق الخلية من خلال الجذعية والانتقال إلى دوامة النبات. وسوف تكون ثقافة تعليق الخلية مرئية في دوامة النبات. استمر في حقن 100 ميكرولتر من ثقافة تعليق الخلية في كل نبات على حدة حتى تصبح الحقنة 3 مل فارغة.
- بعد الحقن، وإزالة الإبرة بعناية من جذع النبات. إزالة الإبرة من حقنة فارغة الآن 3 مل وملء بالماء. قم بإرفاق الإبرة مرة أخرى بالمحاقنة وادفع الماء عبر الإبرة لإزالة أي نسيج نباتي قد يتم التقاطه في طرف الإبرة.
- كرر الخطوات 2.9-2.15 لكل مصنع تجريبي. اتبع نفس البروتوكول لمحطات التحكم عن طريق حقن المياه.
- ضع النباتات التجريبية والتحكمية الملقح مرة أخرى في غرفة النمو. المياه النباتات يوميا عن طريق التبول التربة وليس الأنسجة النباتية.
- تحقق من النباتات يوميا للكشف عن تطور مسببات الأمراض وتفاعلات مقاومة النبات.
3. المقاومة رد فعل الفرز
- تسجيل وتسجيل ردود فعل المقاومة لكل نبات 7 و 10 و 14 و 21 يوما بعد التطعيم (نقطة في البوصة) باستخدام مقياس تقييم رد فعل المقاومة من 1 إلى 5. تزداد شدة المرض مع زيادة القيم العددية على مقياس التصنيف(الجدول 2). A 1C (ليف الكلوروسيس), 1A (ليف إنتاج الأنثوسيانين), أو 2 (أوراق صغيرة غال) رد فعل المقاومة يشير إلى المقاومة. A 3 (الجذعية غال)، 4 (غال القاعدية)، أو 5 (موت النبات) رد فعل المقاومة يشير إلى قابلية(الشكلين 3A-E والجدول 2)18،19.
- تسجيل كل من النباتات التجريبية والسيطرة وتسجيل تقييمات رد فعل المقاومة.
- قارن ردود فعل المقاومة للنباتات التجريبية والسيطرة. حدد النباتات التجريبية مع 1C، 1A، أو 2 مقاومة رد فعل التقييم. وتعتبر هذه النباتات لتكون مقاومة لU. maydis18,19.
- كرر التجربة بأكملها للتحقق من الأنماط الظاهرية النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تحديد تلقيح حقن الإبر الناجح من خلال تصور النمط الظاهري للنباتات التي تم تلقيحها ب U. maydis (تجريبي). وكانت غالبية النباتات التجريبية عرضة للعدوى مايوديس U. وأظهرت النباتات المعرضة للإصابة تطور مرض شديد جدا يتضح من تشكيل الجذعية والغال القاعدية مع teliospores السوداء (الشكلين 3D و 3E، الجدول 2). وقد ماتت عدة نباتات بعد التطعيم بسبب شدة المرض. تم تحديد ثلاثة خطوط للانطواء الذرة x teosinte التي كانت مقاومة لU. maydis. بالنسبة للنباتات المقاومة للداء الميديس U. maydis، فقد ثبت تلقيح ناجح من خلال الكلوروسيس الطفيف ، أو إنتاج الأنثوسيانين ، أو تكوين غال أوراق صغيرة. (الشكلان 3A-C والجدول 2).
وللتحقق من أن النمط الظاهري الملاحظ للنباتات التجريبية كان نتيجة للتلقيح، قورنت الأنماط الظاهرية للمحطات التجريبية ومحطات التحكم (تلقيح المياه). وأظهرت النباتات التجريبية تطور مسببات الأمراض على ورقة و / أو منطقة الجذعية على النحو المبين أعلاه للنباتات المقاومة والمعرضة. وعلى العكس من ذلك، لم تظهر محطات التحكم نمطا فينوبيا. كانت النباتات الضوابط نظيفة جدا ولم تظهر تطور مسببات الأمراض على أي جزء من النبات، مما يشير إلى أن تطور مسببات الأمراض على النباتات التجريبية كان بسبب حقن الإبرة مع U. maydis.
وللتحقق من قابلية استنساخ وكفاءة طريقة تلقيح حقن الإبر، أجريت التجربة مرتين وتتألف من 700 نبتة وقارنت درجات رد فعل المقاومة (الأنماط الظاهرية) للنباتات التجريبية داخل التجارب وفيما بينها لكل خط نباتي. وأظهرت النباتات الأربعة المتماثلة من نفس خط النبات ضمن تجربة واحدة نفس درجة رد فعل المقاومة ل 99.8٪ من النباتات. بالإضافة إلى ذلك، تمت مقارنة النباتات الأربعة المتماثلة بين التجارب وأشارت إلى أن 99.4٪ من النباتات أظهرت نفس درجة رد فعل المقاومة. وهذا يشير إلى أن طريقة تلقيح حقن الإبر يمكن أن توفر بكفاءة ثقافة تعليق الخلية U. maydis بين أوراق النبات وأن التطعيمات والأنماط الظاهرية كانت متسقة داخل التجارب وفيما بينها.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 بذور الذرة المزروعة للتلقيح. أ)ست بذور الذرة وضعت على رأس التربة للزراعة. ب)دفع البذور 1/2 بوصة في التربة مع الاصبع.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم مخطط تدفق عملية تلقيح حقن الإبرة. أ)نمو U. maydis streaked على لوحات المساعد الشخصي الرقمي بعد يومين حضانة في 30 °C. B) شقة من الشتلات القديمة غير الملقح 10 يوما إزالتها من غرفة النمو. ج)حقن الإبرة تلقيح في جذع الشتلات عشرة أيام القديمة مع 100 ميكرولتر من U. مايديس تعليق الخلايا الثقافة.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن استجابات نباتية منشط الذهن للتلقيح حقن إبرة U. maydis. أ)النباتات teosinte مقاومة مع الكلوروسيس ورقة طفيفة التي عرضتها الشرائط البيضاء على الأوراق. يتوافق النمط الظاهري مع درجة تقييم رد فعل مقاومة 1C. ب)مصانع teosinte مقاومة مع إنتاج الأنثوسيانين التي عرضتها لون ورقة الأرجواني. يتوافق النمط الظاهري مع درجة تقييم رد فعل المقاومة 1A. ج)مقاومة النباتات التيوسينتي مع تطوير جال ورقة طفيفة. النمط الظاهري يتوافق مع 2 درجة تقييم رد فعل المقاومة. د)نباتات الذرة المعرضة مع التنمية الجذعية الشديدة وteliospores السوداء. يتوافق النمط الظاهري مع درجة تقييم رد فعل المقاومة 3. ه) نباتات الذرة المعرضة مع التنمية الحادة غال القاعدية. النمط الظاهري يتوافق مع درجة تقييم رد فعل المقاومة 4. الأنماط الظاهرية تتوافق مع مقياس تقييم رد فعل المقاومة وأعراض المرض في الجدول 2. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
| خطوط النبات | الأنواع النباتية | استجابة المقاومة |
| 1. زيا مايز (NSL 30060) | ذرة | مقاوم |
| 2. زيا مايز مايز (PI511562) | تيسينتي | عرضه |
| 3. زيا مايز الفرعية. Parviglumis | تيسينتي | عرضه |
| 4. زيا مايز الفرعية. | تيسينتي | مقاوم |
| 5. زيا مايز الفرعية. | تيسينتي | مقاوم |
| 6. B73 (P1) | ذرة | عرضه |
| 7. بارفيغلوميس (P2) | تيسينتي | عرضه |
| 8. Z031E0560 | الذرة x تيسينتي نيل | مقاوم |
| 9. Z031E0560 | الذرة x تيسينتي نيل | مقاوم |
| 10. Z031E0068 | الذرة x تيسينتي نيل | مقاوم |
| 11. 37 الذرة x teosinte NILs | الذرة x تيسينتي NILs | عرضه |
الجدول 1 - الجداول استجابات المقاومة من الذرة وخطوط teosinte تلقيح مع مايديس U.. P1 يشير إلى الأصل من NILs. يشير P2 الأصل من NILs. يشير NIL إلى الخطوط شبه متساوية المنشأ.
| استجابة المضيف | تصنيف المرض* | أعراض المرض* |
| مقاوم | 1C | مناطق الكلوروتيك قليلة، لا تشكيل غال. |
| مقاوم | 1A | إنتاج الأنثوسيانين الأرجواني الداكن ، تشكلت عدد قليل من المرارة. |
| مقاوم | 2 | غال أوراق صغيرة. |
| عرضه | 3 | غال الجذعية الشديدة مع تشكيل التيليوسام السوداء. |
| عرضه | 4 | غالات القاعدية الكبيرة مع تشكيل التيليوسام الأسود |
| عرضه | 5 | موت النباتات مع أوراق شديدة، الجذعية والجال القاعدية. |
الجدول 2 - الأرباح نظام تصنيف رد فعل المقاومة المستخدمة لتسجيل MAYDIS U. * التقييم وأعراض المرض تتوافق مع الأنماط الظاهرية في الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة كانت طريقة حقن الإبر المستخدمة لتوصيل سلالة من المايديس U. في جذع 700 نبات الذرة والتيوسينت ناجحة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم مقياس منقح لتصنيف مقاومة الأمراض لفحص النباتات والكشف عن تطور مسببات الأمراض. ونتيجة لاستخدام كلتا الطريقتين، تم تحديد خطوط نباتية مقاومة للمايديس U. من بين 700 نبات الذرة والتيوسينت التي يمكن الآن دمجها واختبارها في برامج التربية لتحسين مقاومة الأمراض.
كما هو الحال مع معظم أساليب التطعيم ، فإن القدرة على إعادة إنتاج نفس النمط الظاهري للمقاومة بين النباتات من نفس الخط أمر ضروري. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن لوحظ نفس الأنماط الظاهرية المقاومة في تجربتين منفصلتين على الأقل20،21. لأن القدرة على الحصول على النمط الظاهري النباتي ، سواء كان مقاوما أو عرضة ، يتم تحديدها في المقام الأول من خلال قدرة العامل الممرض على الوصول إلى الأنسجة النباتية ، فمن المهم جدا اختيار طريقة التطعيم التي توفر العامل الممرض بين النبات يترك كل تلقيح. عدد قليل من القضايا الشائعة التي واجهها الباحثون مع طرق تلقيح حقن الإبر باستخدام مسببات الأمراض الفطرية الترويفية الحيوية مثل U. maydis هي: 1) التركيز غير المناسب لمسببات الأمراض الفطرية المستخدمة للتلقيح ، 2) عدم وجود أنماط الظاهرية القابلة للاستنساخ في تجارب متعددة ، و 3) عدم وجود طريقة ثابتة لتسجيل رد فعل المقاومة. هنا يتم تناول كل من القضايا بشكل منفصل.
من المهم تحديد التركيز المناسب لثقافة تعليق الخلايا الممرضة الفطرية المستخدمة للتلقيح8-11،22. التطعيم بتركيزات عالية من ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض سوف يسبب وفاة كل من النباتات المقاومة والمعرضة للخطر، في حين أن تركيزات منخفضة لن تظهر النمط الظاهري على أي نوع من النباتات. ومع ذلك ، فإن التركيز المناسب لثقافة تعليق الخلايا الممرضة الفطرية المستخدمة للتلقيح يختلف باختلاف عدة عوامل بما في ذلك الممرض ، وسلالة الممرض ، والأنواع النباتية ، وانضمام النبات. توفر البروتوكولات الحالية أنماطا الظاهرية وتركيزا لثقافة تعليق الخلية U. maydis لاستخدامها كنقطة انطلاق لاختبار التيتر للتلقيح بالحقن بالإبر. وهذا يؤدي إلى أنماط الظاهرية النباتية متسقة داخل وبين التجارب المختلفة. يمكن أيضا استخدام تركيز ثقافة تعليق الخلية المستخدم للتلقيحات U. maydis كترتكز بدء للتلقيح مع مسببات الأمراض الفطرية الحيوية الأخرى. من المستحسن اختبار تمييعات مختلفة لثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض عند استخدام مسببات الأمراض الفطرية الحيوية الأخرى. وهذا سيسهل اختيار أفضل تركيز لثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض المستخدمة للتلقيح.
يجب عادة تلقيح عدد كبير من النباتات وفحصها من مجموعة من النباتات لتحديد النباتات المقاومة لمسببات الأمراض ذات الأهمية6،23. لذلك ، من المهم استخدام طريقة التطعيم التي توفر بشكل موثوق ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض بين أوراق النبات وأن يتم ذلك بسهولة نسبية والقليل من التلاعب بالنباتات. وهذا من شأنه أن يسهل الأنماط الظاهرية القابلة للاستنساخ في تجارب متعددة. تعطي البروتوكولات الحالية مخططا تفصيليا لتطعيم حقن الإبر في جذع نباتات الذرة والتيوسينت ذات ثقافة تعليق الخلية U. maydis. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتطعيم أنواع نباتية أخرى مماثلة للذرة التيوسينتي. من أجل التسبب في المرض في النبات ، يجب أن ينتقل U. maydis إلى الأنسجة النباتية7،21،24. خلال العدوى الطبيعية، U. maydis ينتقل إلى الأنسجة النباتية من خلال فتحات الفم أو الجروح على سطح ورقة النبات. كما تم استخدام أسلوب التلقيح وتراجع أنبوب دوامة النبات لمحاكاة عملية العدوى الطبيعية U. maydis ولكن كان نجاحا محدودا بسبب التباين في قدرة مسببات الأمراض لاختراق الأنسجة النباتية8-10،25. ومع ذلك ، فإن طريقة تلقيح حقن الإبر توفر ثقافة تعليق الخلية U. maydis بين أوراق النبات مما يلغي مشكلة اختراق مسببات الأمراض.
إنشاء مقياس تصنيف رد فعل المقاومة لU. maydis في ضروري لتحديد النباتات المقاومة لمسبب الأمراض25. تقدم البروتوكولات الحالية وصفا مفصلا لجدول تصنيف المرض من 1 (مقاوم) إلى 5 (عرضة) المحدد لعدوى الميديس الأمريكية من نباتات الذرة والتيوسينت. من العجز القيام أولا بإجراء تلقيح اختبار وفحص عدد صغير من النباتات قبل بدء تجربة واسعة النطاق مع مئات النباتات. ويتألف مقياس تقييم رد فعل المقاومة المحدد في هذا البروتوكول من أنماط وصفية ل 700 نبتة في تجربتين مختلفتين. وينصح بتكرار بروتوكولات التطعيم والفحص مرتين على الأقل لإثبات اتساق النتائج وقابليتها للاستنساخ.
وسيستمر استخدام طريقة التلقيح الحالية لحقن الإبرة ومقياس تصنيف رد الفعل المقاوم المعمول به لفحص واختيار نباتات الذرة و/أو التيوسينت المقاومة للعدوى في مايوديس. ونتيجة لذلك، فإن الطريقتين لها العديد من الآثار الهامة في الزراعة التي يمكن استخدامها في برامج التربية لتحسين المقاومة للعدوى مايوديس الولايات المتحدة خفض خسائر الغلة في الولايات المتحدة وعلى الصعيد الدولي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونشكر الدكتور أمير إسلاموفيتش على المساعدة المختبرية ومساعدة الدفيئة. كما نشكر الدكتورة شيري فلينت غارسيا على توفير خطوط الاستبطان الذرة x teosinte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , ISB News. report http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. Vegetable diseases and their control. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , Academic Press. New York. (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , The American Phytopathological Society. (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
