一种快速高效评估致病性的方法 Ustilago maydis 在玉米和大刍草品系上

本实验的总体目标是通过针头注射法，将 USTA Lago 小鼠细胞悬浮培养物接种，并对玉米 tete 与玉米大刍草杂交内交系进行抗病反应筛选。该过程首先选择用于接种和筛选的植物品系，随后种植用于实验组和对照组针头注射接种实验的种子。

10 天后，将 U 型细胞悬浮液注入每株植物的茎中。最后，比较实验组与对照组植物的抗性反应。最终，通过观察接种了 you.Mais 的植物表型，可以获得成功针头注射接种的结果。

该技术的主要优势在于可将病原体直接递送至叶片之间，从而消除了病原体穿透的问题。实验开始时，选择用于接种和筛选的植株品系，如图所示，本研究采用了两个玉米品系、五个大刍草品系以及40个对玉米霜霉病（Ustilago maydis）抗性尚未明确的玉米-大刍草杂交品系，用于实验组和对照组的针头注射接种实验。

用手指将每种植物品系的四粒种子轻轻按入土壤约半英寸深，再用少量土壤覆盖。然后将种植好的植株放入培养室中，浇水至充分浸润，确保种子在浇水后仍被土壤覆盖。培养条件设置为白天28°C、夜间20°C，光照与黑暗周期分别为14小时和10小时。

冠层顶部的光合有效辐射约为 500 µmol/m²/s。白天和夜间的相对湿度分别维持在约 70% 和 90%，并将所有植株置于同一生长室中，以确保整个实验期间生长环境的一致性。播种后第 8 天，使用无菌接种环从冷冻甘油菌种中取菌，划线接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，在 30°C 下培养两天，并在超净工作台中定期观察，确保菌株生长良好。

使用无菌牙签为每种菌株挑选单个菌落，并将其接种到含有3毫升PD培养基的试管中。将培养物在30摄氏度、200转/分钟的条件下培养两天，并定期检查其生长情况。随后，测定培养物在600纳米处的光密度（OD 600），以确保其生长至OD值为1.0。

用清水将培养物调整至终浓度为每毫升100万个细胞，终体积为30毫升。该致病菌细胞悬浮液浓度可稳定实现对植物的良好侵染。接种前，将所制备的两种菌株等体积混合。

在用细胞悬液填充一支3毫升注射器之前，先用清水填充对照注射器，以便在对植物造成最小损伤的情况下进行注射。将0.457毫米×1.3厘米的皮下注射针头连接至每支注射器的末端。将植物从生长室中取出，并在土壤线稍上方以90度角进行注射。

将U型注射器的针头小心插入实验植株的茎部，直至到达茎的中部。注入约100 µL的细胞悬浮液。液体将穿过茎部，并在进入植株旋心时可见。

继续注射其他实验植株，直至注射器排空。随后用清水填充注射器，以清洗针头上残留的植物组织，并重新装填注射器，直至完成全部植株的注射。使用装有清水的注射器以相同方式注射对照植株。

注射完成后，每天将植物放回生长室。仅对土壤进行浇水，并观察病原体发育情况及植物的抗性反应。

接种后第7、10、14和21天（DPI），使用1至5级的抗性反应评级标准，对每株植物的抗性反应进行评级、评分并记录。评级标准上的数值越高，表示病害严重程度越高。例如，抗性反应等级为1或2表示具有抗性。

三级、四级或五级抗性反应表明敏感。比较实验组与对照组植物的抗性反应，选择抗性反应等级为一级或二级的实验植物。这些植物被认为对麦秆蝇具有抗性。

在本实验中，接种腐殖质的大部分植物均易感病。植株表现出严重的病害症状，表现为茎部和基部形成瘿瘤，并产生黑色冬孢子。由于病害严重，部分植株在接种后死亡。

相比之下，对照植株非常洁净，植株任何部位均未表现出病原菌的发育，表明实验植株上的病原菌发育是由于针刺接种所致。通过针刺接种方法，鉴定出三条对玉米霜指霉（U. maydis）具有抗性的玉米-大刍草杂交品系，并通过轻微的硬化反应、产氰现象或轻微的叶片瘿瘤形成验证了接种成功。该技术可高效实施，并具有良好的可重复性，有助于对大量植株进行接种和表型分析。