Summary
نحن تصف طريقة برمجة الخلايا الجذعية لoverexpress العوامل العلاجية لتكوين الأوعية الدموية باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل. وتشمل العمليات المذكورة التوليف البوليمر، بنقل العدوى إلى خلايا الجذعية المشتقة الدهنية في المختبر، والتحقق من صحة فعالية الخلايا الجذعية المبرمجة لتعزيز الأوعية الدموية في الفئران hindlimb نموذج نقص التروية.
Abstract
التحكم في نمو الأوعية الدموية هو أمر حاسم لنجاح تجديد الأنسجة والتئام الجروح، وكذلك لعلاج الأمراض الدماغية مثل السكتة الدماغية والنوبات القلبية أو أمراض الشرايين الطرفية. النقل المباشر للعوامل النمو عائية لديه القدرة على تحفيز نمو أوعية دموية جديدة، ولكن كثيرا ما يرتبط مع القيود مثل عدم وجود استهداف ونصف العمر القصير في الجسم الحي. يوفر العلاج الجيني نهج بديل عن طريق تقديم الجينات ترميز العوامل عائية، ولكن غالبا ما يتطلب استخدام فيروس، ومحدودة بسبب مخاوف تتعلق بالسلامة. نحن هنا تصف استراتيجية وضعت مؤخرا لتحفيز النمو عن طريق الأوعية الدموية إلى الخلايا الجذعية البرمجة overexpress العوامل عائية في الموقع باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل. على وجه التحديد استخدام استراتيجيتنا الخلايا الجذعية كوسائل التسليم عن طريق الاستفادة من قدرتهم على الهجرة نحو الأنسجة الدماغية في الجسم الحي. باستخدام ناقلات البوليمرية الأمثل، والمستمدة الدهنية-تم تعديل الخلايا الجذعية لoverexpress الجينات عائية ترميز عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). وصفنا العمليات لتخليق البوليمر، وتشكيل جسيمات متناهية الصغر، الجذعية بنقل العدوى إلى خلايا في المختبر، فضلا عن أساليب للتحقق من صحة فعالية الخلايا الجذعية، معربا عن VEGF لتعزيز الأوعية الدموية في الفئران hindlimb نموذج نقص التروية.
Introduction
الهدف العام من هذه التقنية هو تعزيز الأوعية الدموية العلاجية باستخدام الخلايا الجذعية المبرمجة غير فيروسي overexpressing العوامل العلاجية في موقع نقص التروية. تم تعديل الخلايا الجذعية خارج الحي الأولى باستخدام الجسيمات النانوية القابلة للتحلل تصنيعه في المختبر، ومن ثم زرعها في نموذج الفئران من hindlimb نقص التروية للتحقق من صحة إمكاناتها لتعزيز الأوعية الدموية والأنسجة إنقاذ.
التحكم في نمو الأوعية الدموية هو عنصر هام من عناصر نجاح تجديد الأنسجة، وكذلك لعلاج مختلف الأمراض الدماغية مثل السكتة الدماغية ونقص تروية الأطراف، واحتشاء عضلة القلب. وقد وضعت عدة استراتيجيات لتعزيز النمو الأوعية الدموية، بما في ذلك تسليم عامل نمو والعلاج القائم على الخلية. 1 على الرغم من فعالية لوحظ في نماذج الأمراض الحيوانية، وهذه الأساليب لا تزال تواجه القيود مثل ضرورة لجرعات supraphysiological للتسليم عامل النمو، أو عدم كفاية نظير الصماويالافراج من قبل خلايا وحدها. استراتيجية واحدة القدرة على التغلب على القيود أعلاه هو الجمع بين العلاج بالخلايا الجذعية والعلاج الجيني، حيث يتم برمجة الخلايا الجذعية وراثيا خارج الحي قبل الزرع إلى overexpress العوامل العلاجية مرغوب فيه. وقد تجلى هذا النهج في نماذج مختلفة بما في ذلك مرض نقص التروية hindlimb 2، 3 أمراض القلب والعظام الشفاء وإصابة 4 5 العصبية، الخ. ومع ذلك، فإن معظم تقنيات العلاج الجيني تعتمد على ناقلات فيروسية، والتي ترتبط مع مخاوف تتعلق بالسلامة مثل المناعية المحتملة والطفرات إقحامي. الحيوية بوساطة توصيل الجينات غير الفيروسية قد تغلب على هذه القيود، ولكن غالبا ما يعانون من انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن. لتسريع اكتشاف الحيوية رواية لكفاءة توصيل الجينات غير الفيروسية، واستخدمت دراسات حديثة الكيمياء اندماجي ونهج الفرز الفائق الإنتاجية. المكتبات بوليمر القابلة للتحلل مثل بولي (ES-β الأمينيةوقد وضعت النسب) (PBAE) وفرزهم، والتي أدت إلى اكتشاف البوليمرات الرائدة بشكل ملحوظ مع تعزيز كفاءة ترنسفكأيشن بالمقارنة مع نظيراتها التقليدية ناقلات البوليمرية. 6-7
هنا، نحن تصف تركيب PBAE والتحقق من قدرتها على بالنقل الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية (ADSCs) في المختبر، تليها زرع اللاحقة من ADSCs المعدلة وراثيا overexpressing عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) في نموذج الفئران من نقص التروية hindlimb . وتم تقييم نتائج من خلال تتبع مصير الخلية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي، وتقييم ضخه الأنسجة باستخدام الليزر دوبلر نضح التصوير (LDPI)، وتحديد الأوعية الدموية والأنسجة إنقاذ من قبل الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البوليمر التجميعي
- في غطاء الدخان، تزن من 3،523 ملغ من diacrylate بيوتانديول (C) ونقل إلى قارورة زجاجية تحتوي على التلألؤ بقضيب.
- قبل الحرارة 5 الأمينية-1-pentanol (32) إلى 90 درجة مئوية إلى ذوبان الملح، ثم في غطاء الدخان، تزن 1،533 ملغ من 32 وإضافة إلى قارورة التلألؤ تحتوي على C. هذا الأسلوب سوف يؤدي إلى نسبة المولي من C: 32 = 1:1.2.
- وضع على الفور القارورة تحتوي على كل الحلول على طبق من ذهب ضجة. تعيين سرعة ضجة في 600 دورة في الدقيقة.
- نقل قارورة التلألؤ إلى فرن وضعت في 90 درجة مئوية. تعيين سرعة التحريك إلى 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة. إذا كان يحصل على تمسك بقضيب، وانخفاض سرعة. بعد 4 ساعات، وانخفاض سرعة 300 دورة في الدقيقة لوالحفاظ على 90 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة أخرى.
- إضافة 5 غرام من C32 إلى 10 مل من رباعي هيدرو الفوران اللامائية (THF) في قارورة زجاجية تحتوي على التلألؤ بقضيب. التفاف في احباط ودوامة على ارتفاع حتى يذوب تماما.
- في كوب التلألؤ قارورة كونتا منفصلةining بقضيب، إضافة 10 ملم من Tetraethyleneglycoldiamine (122). إضافة 40 مل من THF.
- وضع كل من قوارير (C32 و 122) على طبق من ضجة لمدة 5 دقائق ثم تجمع معا. تغطية في احباط وترك في درجة حرارة الغرفة اثارة في 400 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. ويطلق على المنتج النهائي C32-122.
- تزن من 5 × 50 مل أنابيب فالكون لكل 5 ز دفعة من C32-122. لاحظ كتلة كل أنبوب في جهاز كمبيوتر محمول.
- نقل 30 مل من ايثر اللامائية إلى كل أنبوب 50 مل فالكون.
- نقل 10 مل من C32-122 لكل 50 مل أنبوب فالكون.
- أنابيب دوامة فالكون ثم بقوة الطرد المركزي في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: سوف البوليمر استخراج جمع عند قاعدة الأنبوب.
- تجاهل الحل العلوي وكرر الخطوات من 1.9 و 1.11 مرتين أخريين.
- وضع أنابيب مفتوحة تحتوي على استخراج C32-122 في المجفف وفراغ بين عشية وضحاها. محمية ضمان جميع الأنابيب من الضوء.
- تزن كل أنابيب تحتوي على C32-122 لتحديد كتلة النهائية للالبوليمر المستخرج.
- حل البوليمر المستخرجة في DMSO اللامائية بتركيز 100 ملغ / مل.
- تخزين البوليمر الذائب في -20 ° C محمية من الضوء والرطوبة.
2. البذر الخلية
- ما قبل معطف قاعدة من T-150 قارورة زراعة الأنسجة مع 0.1٪ (وزن / المجلد) الجيلاتين. ينبغي أن تظل الجيلاتين في قارورة لمدة 30-45 دقيقة. طلاء الجيلاتين يساعد التصاق ADSCs.
- نضح الجيلاتين من قبل المغلفة T-150 قارورة.
- إضافة 4 × 10 6 ADSCs (≤ مرور 3) إلى القارورة في 20 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين و 10 نانوغرام / مل bFGF.
- ضع قارورة T-150 في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
- يبدأ الإجراء ترنسفكأيشن في اليوم التالي.
3. تحضير جسيمات متناهية الصغر وترنسفكأيشن
- الإجراء التالي هو لإعداد النانوية التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد 16.1 ميكروغرام لكل1.0 × 10 6 خلايا في البوليمر لالبلازميد نسبة وزن 30:1.
- تمييع DNA البلازميد (1 ملغ / مل، pVEGF165، ND، الولايات المتحدة الأمريكية Aldevron) إلى تركيز النهائي من 120 ميكروغرام / مل في خلات الصوديوم (25 ملم) في أنبوب 15 مل الصقر.
- تمييع C32-122 (100 ملغ / مل) إلى تركيز النهائي من 3.6 ملغ / مل في خلات الصوديوم (25 ملم) في الثانية 15 مل أنبوب فالكون.
- الجمع بين محتويات كل أنابيب فالكون في واحدة 15 مل أنبوب الصقر ودوامة فورا على ارتفاع لمدة 10 ثانية.
- السماح للأنبوب الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لتكوين جسيمات متناهية الصغر تحدث.
- في حين يحتضنها، استبدال المتوسطة في زراعة الأنسجة قارورة مع DMEM تستكمل 7.8 مل بالكامل في 1.0 × 10 6 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
- نقل الحل جسيمات متناهية الصغر إلى قارورة زراعة الأنسجة والميل إلى الأمام وإلى الوراء لنشر بالتساوي.
- ضع قارورة الثقافة الأنسجة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة.
- بعد 2 ساعة، استبدال nanoparticle تحتوي على وسائل الاعلام مع DMEM.
- بعد حضانة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، والخلايا جاهزة للحقن في الجسم الحي.
4. Hindlimb نقص التروية الداخلي
- أجريت جميع التجارب وفقا لجامعة ستانفورد إرشادات جنة رعاية الحيوان واستخدام وافق بروتوكولات APLAC. توليد نموذج الفئران من hindlimb نقص التروية يتم تنفيذ كما هو موضح سابقا. 8 يرجى الرجوع إلى المرجع للحصول على تعليمات مفصلة. ويرد وصف موجز أدناه.
- ضع الماوس تحت التخدير مع 1-3٪ isoflurane والدواء عن طريق الاستنشاق والأكسجين معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة. ضمان عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص القدمين، وانخفاض في معدل التنفس، والخمول.
- إزالة الشعر من منطقة البطن وكل من المناطق hindlimb من الفأرة مع كريم الحلاقة.
- جعل شق في مركز وسطي الفخذ نحو خط الوسط ومن ثم قطع طريق المغطي منصة الدهون لالسابقينتشكل الشريان الفخذي.
- Ligate الشريان في موقعين: موقع القاصي (قريبة إلى الركبة) وموقع الداني (فقط البعيدة إلى الرباط الأربي).
- لإنشاء عملية ربط، فصل الشريان من الوريد وخيط من الحرير خياطة 5-0 حول الشريان. ربط قبالة الشريان مع اثنين من عقدة لجعل ربط.
- إزالة الشريان بين النقطتين ربط.
- غسل المنطقة الجراحية مع برنامج تلفزيوني ثم خياطة شق مغلقة.
- ويمكن الآن إزالة التخدير. إبقاء الحارة الماوس حتى إعادة الصحوة. للحصول على الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، 2-4 ملغ / كغ يدوكائين يمكن حقنها تحت الجلد في موقع شق قبل إعادة الصحوة. ويمكن أن تشمل مزيدا من إدارة الألم تسليم تحت الجلد من 0.05-0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين في 12 و 24 ساعة. رصد الحالة الصحية للالفئران مرة واحدة في اليوم لمدة سبعة أيام من خلال مراقبة التغيرات في نمط التنفس، وألم العلني أو الشدة، ولون البشرة.
- تأكيد hindlimb نقص التروية بواسطة الليزر دوبلر التصوير التروية.
5. حقن الخلايا
- عندما الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل والفئران مستعدون، وغسل الخلايا transfected مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين، الطرد المركزي، ومن ثم الاعتماد.
- الخلايا resuspend في مناطق ذات كثافة من 10 × 10 6 خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني.
- يجب فصل تعليق خلية في أنابيب إيبندورف منفصلة في حجم 110 ميكرولتر. وهذا يضمن أن كل الماوس يتلقى مبلغ مساو من الخلايا.
- وضع كل الماوس تحت التخدير (2.5٪ isoflurane و، 1 لتر / دقيقة معدل تدفق الأكسجين).
- تنظيف موقع الحقن مع مناديل الكحول.
- الاستفادة من وجود حقنة السلين 27 G، واستخلاص الخلايا صعودا وهبوطا في حقنة لضمان تحقيق وقف متجانسة. وضع 100 ميكرولتر من تعليق خلية في حجم الحقنة.
- حقن نصف تعليق خلية في المنطقة العضلة الضامة ومن ثم حقن النصف الآخر في منطقة عضلة ربلة الساق. على طريق الحقن، وترك الحقنة في مكان ما لا يقل عن 15-30 ثانية لمنع تسرب تعليق الخلية.
- الضوابط المناسبة لدراسة الحيوان ما يلي: 1) الخلايا transfected مع البلازميد غير الترميز (مثل البلازميد مع عدم وجود نشاط بيولوجي)، 2) الخلايا وحدها، و 3) برنامج تلفزيوني.
- عندما تكون كاملة الحقن، وإزالة الماوس من التخدير والدفء حتى الماوس إعادة يستيقظ.
6. التصوير تلألؤ بيولوجي
- لبدء التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، تخدير الفئران كما هو موضح أعلاه.
- تنظيف موقع الحقن مع مناديل الكحول.
- استخدام حقنة الأنسولين، تحميل 100 ميكرولتر من 15 ملغ / مل D-وسيفيرين (الركيزة ليراعة luciferase). الحفاظ على الركيزة بعيدا عن الضوء.
- الحقن داخل الصفاق لأداء، وعقد الفئران عن طريق الجلد من ظهورهم لسحب بشرتهم الأمامي مشدود. إدراج إبرة الغشاء البريتونى في منطقة البطن وحقن 100 ميكرولتر من الركيزة.
- ضع الماوس في غرفة التصوير IVIS luciferase المراسل تحت التخدير.
- عندما يتم الحصول على الصورة، بمناسبة المنطقة من اهتمام لقياس إشارة luciferase المراسل. في هذه الحالة، بمناسبة أطرافهم الدماغية في موقع الخلية الحقن.
- مواصلة لقياس إشارة luciferase المراسل كل 3-5 دقيقة حتى تصل إلى إشارة الذروة ويبدأ في الانخفاض. هذه هي القيمة المستخدمة للمقارنة عبر الفئران وعلى مدى عدة نقاط زمنية.
- عندما كاملة، وإزالة الفئران من غرفة والتخدير. الحفاظ على الفئران دافئ حتى إعادة الصحوة.
7. الليزر دوبلر الإرواء التصوير
- يتم إجراء دوبلر الليزر التصوير نضح كما هو موضح سابقا. 8 يوصف هذا الإجراء لفترة وجيزة هنا.
- قبل التصوير دوبلر يجب أن يكون الماوس حليق نظيفة في المناطق التي تغمر كل من hindlimbs ومنطقة البطن لمنع القطع الأثرية بسبب الشعر.
- عندما أعدت لدوبلر الصورة، ومذكرة التفاهمحد ذاته وينبغي تخدير كما هو موضح أعلاه.
- تدفئة الماوس إلى 36 درجة مئوية على طبق ساخن في حين رصد درجة حرارة الجسم عن طريق ترمومتر المستقيم.
- وضع الماوس على سطح غير عاكس أسود والحفاظ على تخدير بواسطة مخروط الأنف. يجب وضع الماوس على السطح الظهري مع أطرافه تتعرض بالتساوي.
- وضع جهاز استشعار ليزر دوبلر ما يقرب من 15 سم فوق الماوس وتوجيه مؤشر ليزر من أجهزة الاستشعار نحو المنطقة الأربية من الفأرة.
- عندما الماوس وأجهزة الاستشعار دوبلر في موقف والصور التي يمكن اتخاذها الاستفادة من البرامج LDPIwin عن طريق الضغط على زر ابدأ.
- يمكن أن تؤخذ القياسات نضح النسبي الذي يدل على حد سواء hindlimbs (الدماغية وغير الدماغية) والمنطقة من المصالح (ROI). فإن نسبة نضح المتوسط من الدماغية إلى hindlimb غير الدماغية تشير نضح النسبية.
8. الأنسجة الحصاد الداخلي
- عندما أعدت لحصاد الماوس تيسرفع دعوى لالأنسجة و / أو المعالجة الكيميائية الحيوية، ينبغي أن يتم التخلص الماوس. هنا، هو الموت الرحيم الماوس من خلال تعريض إلى 5٪ لمدة 3-5 دقيقة isoflurane و، ثم القتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- قطع الجلد المغطي المحيطة hindlimb محيطي في منطقة البطن القاصي والداني إلى hindlimb. يتم قطع الجلد من بطني إلى السطوح الظهرية، مثل أن الجلد يمكن سحبها إلى الوراء على مدى hindlimb في القدم.
- عند سحب الجلد مرة أخرى، يمكن أن بترت أطرافهم خلال استخدام مقص تشريح حادة لقطع في مفصل الحوض وعظم الفخذ.
- تؤخذ اثنين الأنسجة الرئيسي للتحليل: العضلات المقربة وسطي وعضلات الساق.
- لالأنسجة، تضمين واحد أو كلا الأنسجة في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) لcryosectioning.
- لتحليل الكيمياء الحيوية، وجمع واحد أو كلا الأنسجة إلى 1.5 مل إيبندورف ويغرق في حمام من النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل. يمكن أن تكون العيناتتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة التجهيز المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند خلط معا، البوليمر موجبة الشحنة (C32-122) والمشحونة سلبا البلازميد الحمض النووي ذاتيا في الجسيمات النانوية. قد يتم تأكيد تشكيل جسيمات متناهية الصغر من خلال التحليل الكهربائي أي complexation بين C32-122 والبلازميد الحمض النووي سيمنع تعبئة الحمض النووي خلال الكهربائي. يخدم البوليمر بمثابة كاشف ترنسفكأيشن لتسهيل امتصاص المعززة من الحمض النووي في الخلايا المستهدفة والتعبير اللاحقة من البروتينات ترميز (الشكل 2). يمكن transfected الخلايا مع أي الجينات العلاجية أو الحمض النووي مراسل مثل بروتين الفلورية الخضراء (GFP) لتسهيل التحسين السريع للناقلات تصميم وترنسفكأيشن الظروف البوليمرية ذات كفاءة عالية باستخدام الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS) ومضان المجهري (الشكل 3). لADSCs، يعتبر كفاءة أعلى من 20٪ مناسبة.
لتسهيل تتبع مصير الخلية آخر transplanta-نشوئها، وخلايا يمكن transduced ستابلي مع luciferase المراسل، والذي يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من بقاء الخلية والتوزيع في الجسم الحي باستخدام غير الغازية التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI). أظهرت BLI التصوير كثافة عالية إشارة التلألؤ من أطرافهم هند (الشكل 4، اللوحة اليسرى)، مشيرا إلى أن الخلايا المزروعة بقيت في موقع الحقن على مدى عدة أيام، ونحن لا نلاحظ هجرة الخلية ملحوظا نحو الأنسجة أو الأعضاء الأخرى على مدار 21 أيام. إشارة الخلية بشكل عام انخفضت العمل الإضافي واستمرت حتى 14 يوما (الشكل 4، اللوحة اليمنى)، مما يشير إلى أن معظم خلايا المزروعة المتاحة للoverexpressing العوامل العلاجية لتصل إلى 2 أسابيع.
التصوير دوبلر هو أداة مفيدة التي تمكن رصد في الوقت الحقيقي من ضخه الدم إلى الأطراف الدماغية. في اللوحة اليسرى من الشكل 5 هو صورة ممثل تدفق الدم بعد تحريض نقص التروية. منطقة مظلمة يشير إلى نجاححجب sful تدفق الدم بعد الجراحة. يوضح اللوحة اليمنى من الشكل 5 ضخه كاملة من أطرافهم بعد 14 يوما العلاج مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
التقنيات الموضحة أعلاه تسمح في الوقت الحقيقي الكمي، وينبغي أن يقترن إضافية نقطة النهاية يحلل لإجراء دراسة شاملة الكفاءة العلاجية. الأنسجة العضلية التي تلقت الخلايا المزروعة يمكن حصاده عند نقاط زمنية مختلفة للتعبير الجينات والتحليلات النسيجية. RT-PCR يمكن استخدامها لقياس التعبير الجيني في أطرافهم هند لتأكيد الوراثية يصل التنظيم في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عدة أيام بعد الزرع. ويبين الشكل 6 التعبير VEGF في الطرف تعامل الامم المتحدة و، حقن مع برنامج تلفزيوني أو حقنوا VEGF معربا عن ADSCs . وتؤكد النتائج VEGF upregulation في الخلايا غير الفيروسية transfected أربعة أيام بعد الزرع، كذلك تقديم دليل على بقاء الخلية المزروعة.
Histoloتلطيخ gical يسمح التصور المباشر للمورفولوجيا الأنسجة ودرجة تجديد الأنسجة. يمكن أن يقترن التحليل النسيجي لكثافة الأوعية الدموية مع بيانات التصوير دوبلر للمساعدة في تقييم مدى فعالية ضخه الدم (الشكل 7). مورفولوجيا الأنسجة تلطيخ مثل H & E وstainings ثلاثي الألوان ماسون هي مفيدة لتقييم درجة تجديد الأنسجة أو النخر. وتتميز الأنسجة العضلية مجدد حديثا بنجاح من قبل خلايا العضلات مع نواة تقع مركزيا، في حين أن الأنسجة نخرية غالبا ما تظهر تليف الأنسجة كبيرة أو زيادة عدد الخلايا الالتهابية مثل الضامة.
الشكل 1. إنهاء التخطيطي يوضح تركيب بولي (β-الأمينية) استر (PBAE) المستندة إلى متجه C32-122 (A) Acrylated تشكلت C32-AC من قبل بالإضافة إلى ذلك رد فعل مايكل بين مونومر مع diacrylatمجموعات نهاية ه (C) ومونومر مع مجموعة أمين نهاية المرحلة الابتدائية (32). (ب) المعدلة النهاية البوليمرات PBAE يمكن تشكيلها بإضافة أمين مونومرات إنهاء لتعزيز كفاءة ترنسفكأيشن. وقد تم اختيار (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) على أنه أمين مونومر محطة. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. التخطيطي لتشكيل النانوية البوليمرية القابلة للتحلل، والخلية في وقت لاحق يصل تأخذ عملية للتعبير البروتين.
الرقم 3. الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية لجسم الإنسان overexpressing بروتين الفلورية الخضراء (GFP). تم تنفيذ ترنسفكأيشن باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية تشكيلها باستخدام C32-122 وGFP البلازميد الحمض النووي. با مقياسص: 200 ميكرون.
الشكل 4. التصوير تلألؤ بيولوجي ممثل (BLI) البيانات من أطرافه الماوس في اليوم 0 (اللوحة اليسرى) ويوم 14 (اللوحة اليمنى) بعد حقن الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية GFP إيجابية luciferase المراسل في hindlimb الماوس.
الرقم 5. الصور دوبلر ممثل يتظاهرون تحريض نقص التروية في جانب واحد من الفئران hindlimb في اليوم 0 (اللوحة اليسرى)، وناجحة ضخه في الدم بعد 14 يوما من حقن الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة-VEGF overexpressing (اللوحة اليمنى).
الرقم 6. لتأكيد بقاء الخلية وoverexpression من العوامل العلاجية المرمزة في الموقع، الأنسجة يمكن أن تحصد من موقع الحقن لEXPR الجينيحلل ession. أكد RT-PCR ناجحة تصل التنظيم من VEGF، البروتين العلاجي المشفرة، في المجموعة التي تلقت العلاج (ADSC-VEGF) بعد 4 أيام من حقن الخلايا، في حين تم الكشف عن أي التعبير في السيطرة PBS.
الرقم 7. الصورة المناعى ممثل يتظاهرون الكثافة الشعرية التي كتبها تلطيخ مكافحة CD31 في 28 يوما بعد العملية الجراحية شريط مقياس: 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا تقرير طريقة لبرمجة الخلايا الجذعية البالغة لoverexpress العوامل العلاجية باستخدام غير الفيروسية، والجسيمات النانوية القابلة للتحلل. هذه المنصة هي مفيدة بشكل خاص لعلاج الأمراض حيث يمكن الخلايا الجذعية بشكل طبيعي المنزل، مثل نقص التروية والسرطان. 9-10 وعلاوة على ذلك، ومنصة غير الفيروسية تسليم الجينات يسمح للمن overexpression عابرة من العوامل العلاجية، والتي هي مناسبة لمعظم تجديد الأنسجة والجرح عمليات الشفاء. عملية ترنسفكأيشن يعتمد على إدخال الحمض النووي في الخلايا كفاءة، وبصفة عامة يعمل بشكل جيد في تقسيم بنشاط-أنواع الخلايا، ولكن ليس كذلك في الخلايا غير تقسيم. كفاءة ترنسفكأيشن البوليمرات PBAE قد تختلف من نوع من الخلايا إلى نوع من الخلايا، وينبغي أن يكون الأمثل على حدة، ويمكن استكشاف مزيد من التعديلات التركيب الكيميائي لتحقيق الكفاءة المثلى ترنسفكأيشن في السكان الخلية المستهدفة المحددة. 11-12 الخلايا transfected مع الطريقة الموصوفة أعلاه النتائج عادة ما طن التعبير عابرة الجينات وإفراز البروتين لمدة أسبوعين، مع التعبير الجيني الذروة حققت حوالي 2-4 يوم. للالتجارب على الحيوانات، وتعتبر ADSCs مع كفاءة ترنسفكأيشن فوق 20٪ مناسبة. فمن المستحسن لإجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية في كل مرة يتم تغيير معلمة عملية من أجل المحافظة على تناسق (دفعة جديدة مثل البوليمرات، البلازميدات أو خلايا).
بالمقارنة مع الكواشف ترنسفكأيشن المتاحة تجاريا مثل مبادرة التعليم الفلسطينية وLipofectamine عام 2000، والتي هي غير القابلة للتحلل، والبوليمرات PBAE المستخدمة في منصة ذكرت أعلاه هي قابلة للتحلل وأكثر ملاءمة للترجمة السريرية. بالنظر إلى أن مثل هذه النواقل البوليمرية هي تحلل هيدروليكيا 13 و الحساسة للضوء، وينبغي اتخاذ الحذر لتخزين البوليمرات PBAE بشكل صحيح (-20 ° C، في الظلام، مع المجففة) لمنع التحلل غير المرغوب فيها وتدهورها. البوليمرات الناتجة لديها توزيع الوزن الجزيئي، وحجم الاستبعاد اللوني (SEC) مالمنعم يوسف أن يؤديها لمزيد من تنقية PBAEs مع زيادة الكفاءة ترنسفكأيشن 14 ويوصى أيضا لأداء الرنين المغناطيسي النووي (NMR) في كل خطوة في البروتوكول التوليف البوليمر. ينبغي إجراء الرنين المغناطيسي لتأكيد تشكيل C32 من مكوناته الفردية وبالإضافة إلى ذلك مرة أخرى لتأكيد النجاح في نهاية متوجا الجماعات أي 122. ملاحظة: بعد إضافة النهاية متوجا الجماعات، ينبغي للجماعات اكريليت تختفي من الطيف الرنين المغناطيسي النووي. بحضور أمين الزائدة مونومرات إنهاء في البوليمر النهائي يمكن أن يؤدي إلى زيادة السمية الخلية، وبالتالي فإنه من المهم أن تغسل بشكل كاف البوليمر النهائي في ايثر لضمان إزالة مونومرات الزائدة. كما ذكر أعلاه، SEC يمكن أيضا أن تستخدم لزيادة نقاء المنتج النهائي.
على عكس العديد من منصات توصيل الجينات الفيروسية مقرها، ونظام توصيل الجينات البوليمر المستندة المستخدمة هنا لا الاندماج في الجينوم المضيف، وبالتالي تجنب المخاطر المحتملة لإقحامي مutagenesis والمناعية. 15-16
في الإجراء وصفها، يتم زرع الخلايا دون الفرز مباشرة بعد عملية ترنسفكأيشن، والذي يحتوي على خليط من الخلايا overexpressing ترميز البروتينات والخلايا transfected الامم المتحدة. يسمح هذا الإجراء الحد الأدنى من خارج الحي التلاعب في الخلايا، ومن المرجح أن يكون أكثر ترجمة سريريا نظرا تخفيض الوقت والتكلفة وفرص التلوث. ويمكن أيضا أن تطهر خلايا أخرى لتحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلا إلى مزيد من تعزيز مستوى overexpression من العوامل العلاجية في الموقع.
وينبغي دراسة فعالية الخلايا الجذعية المبرمجة لتكوين الأوعية الدموية باستخدام مزيج من فحوصات لتقييم شامل للنتائج على مستويات متعددة بما في ذلك الخلوية، المورفولوجية والفسيولوجية. التصوير تلألؤ بيولوجي يمكن رصد في الوقت الحقيقي من بقاء وتوزيع الخلايا التي تم زرعها مع مرور الوقت. تحليل التعبير الجيني من حارفالأنسجة ested تسمح بالتحقق من بقاء الخلية الوراثية وتصل التنظيم من العوامل المرمزة في الموقع. تلطيخ النسيجية تمكن رؤية مباشرة من كثافة الأوعية الدموية، والتهاب وتجديد الأنسجة. تجدر الإشارة إلى أن زيادة كثافة الأوعية الدموية لا يؤدي دائما إلى النجاح ضخه الدم، والأوعية التي شكلت حديثا يمكن أن تكون غير ناضجة وغير وظيفية. ولذلك فمن المهم لتقييم وظيفة فسيولوجية السفن ولدت حديثا باستخدام الليزر دوبلر التصوير التروية. في حين أن الأساليب المذكورة أعلاه التركيز على استخدام الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية في الأوعية الدموية لتعزيز نموذج hindlimb نقص التروية، ومفهوم الخلايا البرمجة كوسائل تسليم المخدرات ينطبق على نطاق واسع. منصة يمكن تكييفها بسهولة لبرمجة أنواع الخلايا الأخرى لoverexpressing العوامل العلاجية التي هي ذات الصلة لعلاج أمراض أخرى مثل السرطان وأمراض العضلات والعظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه جمعية القلب الأمريكية الوطنية للتنمية منحة عالم (10SDG2600001)، برنامج ستانفورد بيو X التخصصات المبادرة، وبرنامج ستانفورد للأبحاث علماء الطبية للحصول على التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10082 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| 1,4-Butanediol Diacrylate (90 %) | Sigma Aldrich | 411744 | Acronym: C |
| 5-amino-1-pentanol (97 %) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | Acronym: 32 |
| Tetraethyleneglycoldiamine >99 %) | Molecular Biosciences | 17774 | Acronym: 122 |
| Sodium Acetate | G-Biosciences | R010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| Diethyl Ether Anhydrous (>99 %) | Fisher Scientific | E138-4 | |
| DMSO Anhydrous (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G9391 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| D-luciferin | GoldBio | ||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rat IgG | Invitrogen | A11007 |
References
- Deveza, L., Choi, J., Yang, F. Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases. Theranostics. 2, 801-814 (2012).
- Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).
- Mangi, A. A., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).
- Lee, J. Y., et al. Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2. Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).
- Park, K. I., et al. Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury. Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).
- Yang, F., et al. Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors. Gene Ther. 16, 533-546 (2009).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Ceradini, D. J., et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat. Med. 10, 858-864 (2004).
- Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).
- Sunshine, J., et al. Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy. Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).
- Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery. Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Eltoukhy, A. A., et al. Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity. Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).
- Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).
- Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333 (2004).
