编程干细胞的治疗性血管新生使用可生物降解高分子纳米微球

该程序的总体目标是使用海洋后肢缺血模型证明聚合物纳米颗粒在干细胞中过表达治疗基因。这是通过首先通过两步 mic edition 反应合成可生物降解的聚合物，然后制造编码治疗基因的聚合物纳米颗粒来实现的。第二步是在体外将人脂肪来源的干细胞转染给过表达的血管内皮生长因子。

接下来，将编程的干细胞肌肉注射到缺血的后肢中，用于 NC 两种治疗因子的产生。最后一步是使用生物发光成像和激光多普勒成像监测缺血肢体中的细胞存活和血液再灌注随时间的变化。最终，可以进行定量基因表达和组织学研究，以显示治疗因子的局部表达和组织再生的功效。

与传统的血管生成方法相比，该技术的优势在于使用干细胞作为药物递送的载体。这种策略使我们能够利用干细胞的自然 ho 能力迁移到缺血，并允许对微环境线索做出动态反应。用于血浆 DNA 递送的纳米颗粒高效且可生物降解，具有较低的细胞毒性和更多的细胞内递送 DNA 拷贝。

该技术可应用于许多临床相关的基于细胞的疗法，因为它利用可生物降解的非病毒载体将基因插入自体细胞中 在通风橱中工作，称量丁烷刻度盘 DLI，并将材料转移到装有搅拌棒的玻璃吸入瓶中。接下来，将预热的 5 个氨基 1 戊醇加入同一个小瓶中。立即将样品瓶放在搅拌板上，并将速度设置为 600 RPM。

将样品瓶转移到设置为 90 摄氏度的烘箱中，4 小时后将搅拌速度提高到 1000 RPM，将速度降低到 300 RPM 并再搅拌 12 至 16 小时。准备好后，将 10 毫升无水四氢尿酸加入 5 克 C 32 中，放入装有搅拌棒的玻璃瓶中。用铝箔涡旋包裹直至完全溶解在含有搅拌棒的单独玻璃瓶中后，加入 10 毫摩尔的四乙二醇二胺。

向该样品瓶中加入 40 ml THF，将两个样品瓶放在搅拌板上 5 分钟，然后将它们混合在一起。用箔纸覆盖所得物质，并在室温下凝视 24 小时。最终产品称为 C 32 1 22。

接下来，将 30 毫升无水达乙醚转移到五个 50 毫升 falcon 管中。将 C 32 1 22 加入无水乙醚中后，形成白色浑浊溶液，涡旋试管，然后离心。提取的聚合物将聚集在试管底部，丢弃上层溶液，然后再重复这些步骤两次。

提取后，将打开的试管放入干燥物中并抽真空过夜，确保试管避光。第二天称量含有 C 32 1 22 的试管以确定最终质量。最后将提取的聚合物以 100 毫克/毫升的浓度溶解在无水 DMSO 中。

用于纳米颗粒制备。首先，在乙酸钠中将血浆 DNA 稀释至终浓度为 120 μg/mL，在第二管中，将 C 32 1 22 稀释至终浓度为 3.6 mg/mL。在乙酸钠中，将每管的内容物混合到一个 15 毫升的 Falcon 管中，并立即以高位涡旋 10 秒。

让试管在室温下静置 10 分钟，以便在纳米颗粒形成的同时形成纳米颗粒。将先前放置的组织培养瓶中的培养基更换为 7.8 mL。完全补充 DMEM。

将纳米颗粒溶液转移到组织培养瓶中，均匀涂抹，然后放入培养箱中。两小时后，用 DMEM 替换含有纳米颗粒的培养基。4 小时后，细胞即可进行体内注射。

当转染的细胞准备好后，在 PBS 中以每毫升 6 个细胞的 10 倍的 10 倍的密度对细胞进行计数，以确保每只小鼠获得相等的量。将细胞悬液分离到体积为 110 μL 的 einor 管中。接下来，麻醉先前经历过后肢缺血的小鼠。

通过脚趾捏确认麻醉后，用 27 号注射器清洁注射部位。重新悬浮细胞并吸取 100 微升悬浮液。将一半的细胞悬液注射到内收肌区域，然后将另一半注射到小腿肌肉区域。

注射后，将注射器留在原位至少 15 到 30 秒，以防止泄漏。注射完成后，让动物保持温暖，直到完全恢复。对于生物发光成像，用脚趾捏确认麻醉，然后如前所述清洁注射部位。

在胰岛素注射器中加入 100 微升 Lucifer 并腹膜内注射。在将动物放入 ivus 荧光素酶成像室之前，以一分钟的曝光时间为小鼠成像。采集图像后，标记感兴趣的区域。

在这种情况下，细胞注射部位的缺血肢体继续每 3 到 5 分钟测量一次荧光素酶信号，直到信号达到峰值并开始下降。这是用于在小鼠之间和时间点之间进行比较的值，完成后，将小鼠从腔室中取出并保持动物温暖，直到完全恢复。组织在选定的时间收获。

安乐死后转染后的穴位，在腹部远端区域和后肢近端沿圆周切割后肢周围的皮肤。将皮肤拉回后，截肢骨盆和股骨关节之间的肢体。最后，分离内收肌和腓肌。

为了进一步分析，这些图像描绘了 C 32 1 22 的综合。在这里，ACR 相关终止 C 32 AC 是由具有 DAL 端基的单体和具有初级 am 平均端基的单体之间的 mic 编辑反应形成的。在这个例子中，可以通过添加平均终止单体来形成改性的 PBAE 聚合物，以提高转染效率。

绿色荧光蛋白的过表达可以明显地实现成功的转染。该生物发光成像数据显示了第 0 天和第 14 天的小鼠。将 GFP 荧光素酶阳性脂肪来源的干细胞注射到后肢后，代表性的多普勒图像显示，在第 0 天镜像后肢的一侧诱导缺血并成功进行血液再灌注。

注射 VEGF 后 14 天表达脂肪来源的干细胞。R-T-P-C-R 证实细胞注射后 4 天治疗组编码的治疗蛋白 vgf 成功上调，而在 PBS 对照中未检测到表达。可以进行其他应用干细胞和基因递送相结合的方法，以确定促进组织再生的新治疗靶点。

看完这个视频，你应该对如何合成可生物降解的聚合物用于非病毒基因治疗，并使用这些聚合物对干细胞进行编程以治疗缺血和体内有一个很好的了解。使用非病毒工程干细胞在原位过表达治疗因子可能广泛用于治疗各种退行性疾病。