编程干细胞的治疗性血管新生使用可生物降解高分子纳米微球
September 27th, 2013
我们描述了编程干细胞的方法，使用可生物降解的聚合物纳米颗粒以过表达的治疗因子的血管生成。所述工艺包括聚合物的合成，转染脂肪来源的干细胞在体外和验证编程的干细胞的功效，以促进血管生成的小鼠后肢缺血模型。
该程序的总体目标是使用海洋后肢缺血模型证明聚合物纳米颗粒在干细胞中过表达治疗基因。这是通过首先通过两步 mic edition 反应合成可生物降解的聚合物，然后制造编码治疗基因的聚合物纳米颗粒来实现的。第二步是在体外将人脂肪来源的干细胞转染给过表达的血管内皮生长因子。
接下来，将编程的干细胞肌肉注射到缺血的后肢中，用于 NC 两种治疗因子的产生。最后一步是使用生物发光成像和激光多普勒成像监测缺血肢体中的细胞存活和血液再灌注随时间的变化。最终，可以进行定量基因表达和组织学研究，以显示治疗因子的局部表达和组织再生的功效。
与传统的血管生成方法相比，该技术的优势在于使用干细胞作为药物递送的载体。这种策略使我们能够利用干细胞的自然 ho 能力迁移到缺血，并允许对微环境线索做出动态反应。用于血浆 DNA 递送的纳米颗粒高效且可生物降解，具有较低的细胞毒性和更多的细胞内递送 DNA 拷贝。
该技术可应用于许多临床相关的基于细胞的疗法，因为它利用可生物降解的非病毒载体将基因插入自体细胞中 在通风橱中工作，称量丁烷刻度盘 DLI，并将材料转移到装有搅拌棒的玻璃吸入瓶中。接下来，将预热的 5 个氨基 1 戊醇加入同一个小瓶中。立即将样品瓶放在搅拌板上，并将速度设置为 600 RPM。
将样品瓶转移到设置为 90 摄氏度的烘箱中，4 小时后将搅拌速度提高到 1000 RPM，将速度降低到 300 RPM 并再搅拌 12 至 16 小时。准备好后，将 10 毫升无水四氢尿酸加入 5 克 C 32 中，放入装有搅拌棒的玻璃瓶中。用铝箔涡旋包裹直至完全溶解在含有搅拌棒的单独玻璃瓶中后，加入 10 毫摩尔的四乙二醇二胺。
向该样品瓶中加入 40 ml THF，将两个样品瓶放在搅拌板上 5 分钟，然后将它们混合在一起。用箔纸覆盖所得物质，并在室温下凝视 24 小时。最终产品称为 C 32 1 22。
接下来，将 30 毫升无水达乙醚转移到五个 50 毫升 falcon 管中。将 C 32 1 22 加入无水乙醚中后，形成白色浑浊溶液，涡旋试管，然后离心。提取的聚合物将聚集在试管底部，丢弃上层溶液，然后再重复这些步骤两次。
提取后，将打开的试管放入干燥物中并抽真空过夜，确保试管避光。第二天称量含有 C 32 1 22 的试管以确定最终质量。最后将提取的聚合物以 100 毫克/毫升的浓度溶解在无水 DMSO 中。
用于纳米颗粒制备。首先，在乙酸钠中将血浆 DNA 稀释至终浓度为 120 μg/mL，在第二管中，将 C 32 1 22 稀释至终浓度为 3.6 mg/mL。在乙酸钠中，将每管的内容物混合到一个 15 毫升的 Falcon 管中，并立即以高位涡旋 10 秒。
让试管在室温下静置 10 分钟，以便在纳米颗粒形成的同时形成纳米颗粒。将先前放置的组织培养瓶中的培养基更换为 7.8 mL。完全补充 DMEM。
将纳米颗粒溶液转移到组织培养瓶中，均匀涂抹，然后放入培养箱中。两小时后，用 DMEM 替换含有纳米颗粒的培养基。4 小时后，细胞即可进行体内注射。
当转染的细胞准备好后，在 PBS 中以每毫升 6 个细胞的 10 倍的 10 倍的密度对细胞进行计数，以确保每只小鼠获得相等的量。将细胞悬液分离到体积为 110 μL 的 einor 管中。接下来，麻醉先前经历过后肢缺血的小鼠。
通过脚趾捏确认麻醉后，用 27 号注射器清洁注射部位。重新悬浮细胞并吸取 100 微升悬浮液。将一半的细胞悬液注射到内收肌区域，然后将另一半注射到小腿肌肉区域。
注射后，将注射器留在原位至少 15 到 30 秒，以防止泄漏。注射完成后，让动物保持温暖，直到完全恢复。对于生物发光成像，用脚趾捏确认麻醉，然后如前所述清洁注射部位。
在胰岛素注射器中加入 100 微升 Lucifer 并腹膜内注射。在将动物放入 ivus 荧光素酶成像室之前，以一分钟的曝光时间为小鼠成像。采集图像后，标记感兴趣的区域。
在这种情况下，细胞注射部位的缺血肢体继续每 3 到 5 分钟测量一次荧光素酶信号，直到信号达到峰值并开始下降。这是用于在小鼠之间和时间点之间进行比较的值，完成后，将小鼠从腔室中取出并保持动物温暖，直到完全恢复。组织在选定的时间收获。
安乐死后转染后的穴位，在腹部远端区域和后肢近端沿圆周切割后肢周围的皮肤。将皮肤拉回后，截肢骨盆和股骨关节之间的肢体。最后，分离内收肌和腓肌。
为了进一步分析，这些图像描绘了 C 32 1 22 的综合。在这里，ACR 相关终止 C 32 AC 是由具有 DAL 端基的单体和具有初级 am 平均端基的单体之间的 mic 编辑反应形成的。在这个例子中，可以通过添加平均终止单体来形成改性的 PBAE 聚合物，以提高转染效率。
如图所示，绿色荧光蛋白的过表达可以明显地实现成功的转染。该生物发光成像数据显示了第 0 天和第 14 天的小鼠。将 GFP 荧光素酶阳性脂肪来源的干细胞注射到后肢后，代表性的多普勒图像显示，在第 0 天镜像后肢的一侧诱导缺血并成功进行血液再灌注。
注射 VEGF 后 14 天表达脂肪来源的干细胞。R-T-P-C-R 证实细胞注射后 4 天治疗组编码的治疗蛋白 vgf 成功上调，而在 PBS 对照中未检测到表达。可以进行其他应用干细胞和基因递送相结合的方法，以确定促进组织再生的新治疗靶点。
看完这个视频，你应该对如何合成可生物降解的聚合物用于非病毒基因治疗，并使用这些聚合物对干细胞进行编程以治疗缺血和体内有一个很好的了解。使用非病毒工程干细胞在原位过表达治疗因子可能广泛用于治疗各种退行性疾病。
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概述
本研究展示了使用生物可降解聚合物纳米粒子来编程干细胞以过表达治疗因子，旨在促进血管生成。该方法使用小鼠后肢缺血模型进行验证。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞治疗
- 血管生成
- 生物可降解纳米粒子
背景
- 治疗基因过表达可增强组织再生。
- 聚合物纳米粒子可作为基因的有效载体。
- 脂肪来源的干细胞是再生医学的一个有前景的来源。
- 后肢缺血模型常用于研究血管生成。
研究目的
- 编程干细胞以过表达血管内皮生长因子（VEGF）。
- 评估这些编程干细胞在促进血管生成方面的效果。
- 评估生物可降解纳米粒子在基因递送方面的潜力。
所用方法
- 通过两步反应合成生物可降解聚合物。
- 制备编码治疗基因的聚合物纳米粒子。
- 体外转染人脂肪来源的干细胞。
- 将编程干细胞注射到缺血后肢以进行评估。
主要结果
- 成功转染干细胞，导致VEGF过表达。
- 在缺血肢体中观察到血液再灌注改善。
- 定量基因表达分析证实了治疗因子的局部表达。
- 组织学评估显示组织再生。
结论
- 生物可降解聚合物纳米粒子有效地将治疗基因递送到干细胞。
- 编程干细胞可以显著增强缺血条件下的血管生成。
- 这种方法对未来的再生疗法具有潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This approach addresses the challenge of targeted and sustained delivery of angiogenic factors in ischemic tissue repair, leveraging stem cell homing and biodegradable non-viral vectors to improve therapeutic precision. By programming autologous stem cells to overexpress VEGF in situ, the method enhances predictive confidence in preclinical angiogenesis models and supports de-risking of cell-based regenerative strategies. It enables a translatable platform for ischemic disease applications where controlled vascular growth is critical for tissue regeneration and wound healing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF-driven angiogenic pathways through controlled overexpression in stem cells.
- Operational Value: Uses adipose-derived stem cells as a scalable, autologous delivery vehicle for therapeutic genes.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking gene expression to functional reperfusion outcomes in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized system for evaluating non-viral gene delivery efficiency in stem cells via VEGF overexpression.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of transgene expression and angiogenic response using bioluminescence and Doppler imaging.
- Scientific Value: Supports assay reproducibility through standardized nanoparticle formulation and stem cell transfection protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates therapeutic angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model, validating disease-relevant system performance.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of cell survival and blood reperfusion, enabling longitudinal efficacy assessment.
- Scientific Value: Connects localized VEGF expression to tissue regeneration endpoints, supporting translational biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from stem cell engineering to preclinical validation, supporting hypothesis testing in angiogenesis and enabling scalable cell therapy workflows.
- Discovery Biology: Supports VEGF pathway interrogation and target validation through inducible overexpression in stem cells.
- Screening: Enables standardized assessment of gene delivery efficiency and angiogenic potency in vitro and in vivo.
- Analytics: Generates quantitative gene expression, bioluminescence, and perfusion readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Demonstrates continuity from stem cell programming to functional angiogenesis in ischemic tissue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable non-viral vector platform for programming stem cells across multiple therapeutic gene targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in angiogenic target validation through controlled, localized factor expression.
- Operational Value: Offers a biodegradable, non-viral delivery system with lower cytotoxicity and high DNA loading capacity.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in stem cell-mediated angiogenesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of VEGF and other angiogenic targets in ischemic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry, nanoparticle formulation, and stem cell culture and transfection.
- Needs access to inert atmosphere equipment for polymer synthesis and sterile cell culture facilities for transfection.
- Demands standardization of nanoparticle size, charge, and DNA loading across batches for reproducible transfection.
- Requires adaptation of dosing and injection protocols when translating across different stem cell sources or ischemic models.
- Limited by the need for in vivo imaging infrastructure to longitudinally track cell survival and therapeutic efficacy.
