Summary
Vi presentiamo un nuovo idrogel di poliacrilamide, chiamato idrossi-PAAM, che permette un legame diretto di proteine ECM con un costo minimo o esperienza. La combinazione di idrossi-PAAM Idrogel con stampa microcontact facilita il controllo indipendente di molti spunti del microambiente naturale delle cellule per studiare mechanostransduction cellulare.
Abstract
E 'ormai ben noto che molte funzioni cellulari sono regolate da interazioni delle cellule con spunti fisico-chimiche e meccaniche della loro matrice extracellulare (ECM) ambiente. Le cellule eucariotiche sentono costantemente il loro microambiente locale attraverso meccanosensori superficie di trasdurre i cambiamenti fisici di ECM in segnali biochimici, e integrare questi segnali per raggiungere specifici cambiamenti nell'espressione genica. È interessante notare che i parametri fisico-chimiche e meccaniche della coppia ECM lattina con l'altro per regolare destino cellulare. Pertanto, una chiave per comprendere meccanotrasduzione è quello di disaccoppiare il contributo relativo di spunti ECM sulle funzioni cellulari.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato sperimentale per generare rapidamente e facilmente idrogel biologicamente rilevanti per la messa a punto indipendente di spunti meccanotrasduzione in vitro. Noi idrogel di poliacrilamide modificati chimicamente (PAAM) per superare i loro intrinsecamente non ADHESive proprietà incorporando monomeri di acrilammide idrossile-funzionalizzati durante la polimerizzazione. Abbiamo ottenuto un romanzo PAAM idrogel, chiamato idrossi-PAAM, che consente l'immobilizzazione di qualsiasi natura desiderato di proteine ECM. La combinazione di idrossi-Paam Idrogel con stampa microcontact permette di controllare indipendentemente la morfologia delle cellule singole, la rigidità della matrice, la natura e la densità delle proteine ECM. Mettiamo a disposizione un metodo semplice e rapido che può essere impostato in ogni laboratorio di biologia per studiare nei processi meccanotrasduzione cellule in vitro. Abbiamo convalidare questo romanzo piattaforma bidimensionale conducendo esperimenti sulle cellule endoteliali che dimostrano un accoppiamento meccanico tra ECM rigidità e il nucleo.
Introduction
Molti aspetti del microambiente cellulare locale (ad esempio, la rigidità, dimensione dei pori, la natura delle proteine, o di densità delle cellule-ligando) forniscono una serie coordinata di spunti normativi che controllano processi cellulari come la motilità, proliferazione cellulare, differenziamento, e l'espressione genica. Le modifiche delle proprietà fisico-chimiche dell'ambiente extracellulare possono essere percepiti dalle cellule e causare diverse conseguenze fisiologiche, tra cui la deformazione della polarizzazione cellulare, la migrazione e la differenziazione. Non è chiaro, tuttavia, come le cellule traducono ECM modifiche in segnali biochimici cellulari. E 'quindi di grande importanza per Ingegnere controllata in microambienti in vitro in grado di riprodurre le interazioni tra cellule e il loro microambiente per studiare percorsi meccanotrasduzione. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente introdotto un nuovo metodo 1, chiamato idrogel-PAAM idrossi, di generare facilmente due dimematrici nsional morbidi che permettono di controllare in modo indipendente importanti spunti meccanotrasduzione: rigidezza, matrice di geometria cellulare e confinamento, la natura delle proteine e densità cellulare-ligando.
ECM dirige processi cellulari attraverso gradienti in morphogens (chemiotassi), proteine adesive (haptotaxis) e rigidità (durotaxis). Nel corso degli ultimi decenni, avanzata in piattaforme vitro sono stati sviluppati per isolare questi segnali extracellulari, al fine di prendere in giro fuori come le cellule sono in grado di tradurre le caratteristiche biochimiche e biofisiche in processi fisiologici 2-5. Sono stati sviluppati a fascio elettronico 6, fotolitografia 7, 8 immobilizzazione fotochimico o tecniche plasma assistita 9 per dirigere la crescita delle cellule viventi su substrati micropatterned. Anche se queste tecniche hanno dato risultati importanti, la maggior parte di essi non consentono una discriminazione tra l'influenza individuale di diversi spunti sul comportamento delle cellulee richiedono attrezzature tecniche che pochi laboratori possono permettersi. Tra queste tecniche, stampa microcontact (μCP), è emerso come un metodo affidabile e accessibile per creare cellule-adesivo micro-isole 10. Più di recente, grandi sforzi 11-14 sono stati fatti per sviluppare μCP su idrogel con rigidità accordabili in modo da riprodurre la vasta gamma di rigidità osservati nei tessuti viventi. Tra queste opere, poliacrilammide (PAAM) è diventata popolare 15 ed è già una delle matrici a base di polimeri più comunemente usati per la biomeccanica cellulari saggi.
Superfici Paam sono comunemente funzionalizzati con il eterobifunzionale reticolante N-sulfosuccinimidyl-6-proteine [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (solfo-SANPAH) e ECM sono legati alla superficie mediante attivazione UV del nitrofenil solfo-SANPAH gruppi azide 16. Un'altra tecnica consiste nel idrazina accoppiamento a proteine che sono stati gravemente ossidaticon periodato 17. Hynd e collaboratori hanno introdotto una tecnica per patterning di superfici idrogel biomimetici con proteine e peptidi che richiede fotopolimerizzazione in presenza di un monomero acroyl-streptavidina 18. Più recentemente, Tseng et al. Hanno segnalato un nuovo metodo micropatterning 19 sulla base dell'esposizione ai raggi UV profondo di PAAM attraverso una maschera di quarzo ottico che richiede di incubare gel PA attivati con 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC) e N-idrossisuccinimmide (NHS) soluzioni di acqua prima di aggiungere la proteina. Nonostante la capacità di queste tecniche per creare omogenei e riproducibili proteine microdisegni, la maggior parte di loro soffrono maggiori limitazioni: processi lunghi di sintesi (ad esempio, dialisi, liofilizzazione, ecc), composti chimici costosi (ad esempio, l'acido ialuronico, solfo-SANPAH) o UV profondo irradiazione. Inoltre, queste tecniche non consentono la modulazione indipendente substrato rigidità, micropatterngeometria, ECM natura proteica, e la densità delle cellule-ligando.
Prendendo queste limitazioni in considerazione, abbiamo sviluppato un nuovo approccio e semplice a base di acrilammide, che consente l'immobilizzazione di una varietà di proteine e biomolecole su idrogel morbido e permette la sintonizzazione indipendente di spunti meccanotrasduzione al fine di decifrare il loro ruolo sulle funzioni cellulari. Invece di trattare idrogel PAAM con composti chimici aggressivi, introduciamo un monomero acrilammide commerciale con gruppi idrossilici PAAM durante la polimerizzazione. Questa semplice operazione supera la proprietà anti-adesive intrinseca degli idrogel PAAM senza altri requisiti tecnici.
La presenza di gruppi ossidrilici porta ad una elevata affinità di idrogel-idrossi Paam per proteine e biomolecole che formano interazioni di idrogeno-bonding. In combinazione con μCP, idrogel-PAAM idrossi consentono una rapida generazione di piattaforma cultura bidimensionale con un controllo indipendentesulla rigidità matrice, tipo di proteine ECM, densità cellulare-ligando e adesività limitata, che si immaginava di essere una potente piattaforma per lo studio meccanotrasduzione.
Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per rendere facilmente idrogel-PAAM idrossi senza alcuna competenza in scienze dei materiali. L'obiettivo finale è quello di fornire un mezzo per i ricercatori di porre domande fisiologicamente rilevanti a livello cellulare e dei tessuti che possono portare ad una migliore comprensione delle vie meccanotrasduzione coinvolti nei meccanismi fisiopatologici.
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Protocol
1 Attivazione della superficie di coprioggetto di vetro
- Luogo coprioggetto di vetro circolare (diametro 25 mm) in una capsula di Petri e striscio 0,1 M di NaOH soluzione su di esso per 5 min (cappa consigliata).
- Rimuovere la soluzione di NaOH e immergere completamente coprioggetto con DDH 2 O sterile per 20 minuti mentre delicatamente dondolo su un piatto oscillante in una cappa sterile cultura.
- Scolare sterile DDH 2 O e ripetere il passaggio 1.2.
- Togliere i coprioggetti con una pinzetta sterile e metterli in un nuovo piatto di Petri con la faccia attivata alto.
- Coprioggetti secco sotto un flusso costante di gas azoto ad alta purezza.
- In una cappa sterile cultura, spalmare uno strato sottile di 3-acrilato (trimetossisilil) propil (92%) sul lato attivo del vetrino per 1 ora.
- Ampiamente lavare vetrini con 3 lavaggi di DDH 2 O sterile e immergerli in DDH 2 O sterile in un nuovo piatto di Petri.
- Toccare la piastra di Petricon Parafilm e metterlo su un piatto rocker sotto agitazione per 10 min.
- Togliere i coprioggetti dai DDH 2 O con una pinzetta sterile con punte sottili e metterli in un nuovo piatto di Petri con la faccia attivata alto.
- Conservare a temperatura ambiente in un luogo asciutto con un foglio di alluminio per evitare che la polvere di attaccarsi i coprioggetti.
2 Preparazione di idrossi-PAAM idrogel
- Preparare un peso di 65 mg di N-idrossietil acrilammide (HEA) in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. È importante preparare una soluzione HEA fresca.
- Aggiungere 1 ml di tampone HEPES 50 mM a HEA e mescolare utilizzando un vortex fino a quando la dissoluzione HEA completo.
- Aggiungere 400 ml di 40% w / w in HEPES soluzione di acrilammide e il volume del 2% richiesto w / w in HEPES soluzione di bis-acrilammide (vedi Tabella 1) per raggiungere la rigidità idrogel desiderata. Regolare con HEPES 50 mM ad un volume finale di 5 ml.
- Mescolare la soluzione con un vortex e Degas itin una camera a vuoto per 20 minuti al fine di ridurre la concentrazione di ossigeno all'interno della soluzione, che impedisce idrossi-Paam polimerizzazione.
- Sotto una cappa sterile, filtrare la soluzione degased con un filtro di dimensione dei pori di 0,2 micron per sterilizzarlo.
- Attivare vetrini circolari (diametro 22 mm) in un pulitore UV / ozono durante 7 min.
- Preparare 100 ml di soluzione al 10% di ammonio persolfato (APS), che è di 10 APS mg su 100 ml DDH 2 O. È importante preparare una soluzione APS fresca.
- Aggiungere 2,5 ml di tetramethylenediamine (TEMED) e 25 ml di soluzione di APS al idrossi-PAAM soluzione sterilizzata (punto 2.5) per avviare la polimerizzazione. Miscelare la soluzione da 3 pipettaggi successive senza introduzione di bolle, in condizioni di sterilità.
- Sotto una cappa sterile, una goccia 25 ml della soluzione di idrossi-PAAM su un coprioggetto 25 mm (disponibile dal punto 1.9) e subito mettere un gl 22 millimetriass coprioggetto (preparato nel passaggio 2.5) sulla parte superiore della goccia per spremere la soluzione idrossi-PAAM. Centrare il coprioggetto di vetro 22 millimetri con una pinzetta sterile e appianare eventuali bolle.
- Consenti idrogel-idrossi PAAM a polimerizzare a temperatura ambiente per 15 min. Invertire manualmente la restante soluzione idrossi-Paam nel tubo Eppendorf a seguire il completamento del processo di polimerizzazione.
- Immergere completamente coprioggetto con sterile DDH 2 O e separare con attenzione le 22 coprioggetto mm di vetro, introducendo il bordo di una lama di rasoio tra i 22 coprioggetto mm di vetro e lo strato di idrogel idrossi-PAAM.
- Lavare idrogel-idrossi PAAM con PBS sterile (3 scambi di PBS), e lasciare che i gel completamente immersi in PBS sterile per mantenere l'idratazione.
- Conservare idrogel-idrossi PAAM in PBS sterile a 4 ° C per un massimo di 3 giorni.
3. polidimetilsilossano (PDMS) Microstamp Fabrication
NOTA: La realizzazione di un maestro di silicio è necessario prima di staRT Il PDMS fabbricazione microstamp. Questo microfabbricazione di un maestro di silicio può essere fatto con tecniche litografiche, che richiede attrezzature e formazione specializzata. Collaborazioni con un impianto di nanofabbricazione sono incoraggiati a realizzare il master di silicio. In alternativa, contattare una società che fabbrica i padroni di silicio microstrutturato personalizzati su richiesta. È importante notare che la realizzazione del master silicio deve solo essere fatto una volta. Infatti, maestri di silicio microstrutturate possono essere utilizzati a tempo indefinito per produrre francobolli elastomerici.
- Mix PDMS e il catalizzatore in un rapporto di 10: 1 in un bicchiere di plastica e mescolare accuratamente con una pipetta per 10 min.
- Degassare la miscela PDMS sotto vuoto per rimuovere le bolle d'aria che si sono formate durante la fase 3.1.
- Posizionare il maestro silicio microstrutturata in una capsula di Petri e gettato uno strato di spessore di 10 mm di miscela degasato PDMS su di essa senza formare bolle.
- Lasciate curare le PDMS per 2 ore a 60 ° C in unforno.
- In un ambiente privo di polvere, peel-off lo strato PDMS e accise 1 cm 2 microstamps con un bisturi.
- Utilizzando pinze, posto PDMS microstamps modello-up in una capsula di Petri.
4. micropatterning idrossi-PAAM idrogel
- Luogo PDMS microstamps in un etanolo / acqua e la soluzione sonicare (50/50) per 15 min.
- Asciugare i francobolli con un flusso di flusso di azoto e di metterli modello-up in un pulitore UV / ozono (λ <200 nm) per 7 min.
- Sotto una cappa sterile, mettere una goccia di 150 ml di una soluzione di proteina desiderata (ad esempio, 100 mg / ml in PBS laminina o 25 mg / ml di fibronectina in PBS) sulla superficie microstrutturata di un 1 cm 2 PDMS bollo.
- Opzionale: Modificare la concentrazione della soluzione proteica di modulare la densità cellulare-ligando.
- Stendere la soluzione proteica sulla superficie timbro muovendo con una punta sterile di una pipetta verso l'angolo diil timbro.
- Lasciare la soluzione proteica per assorbire il timbro PDMS per 60 minuti sotto una cappa sterile. Spegnere le lampade per evitare danni proteine.
- Sotto una cappa sterile, trasferire vetrini rivestiti idrossi-PAAM (disponibili dal punto 2.13) in una capsula di Petri.
- Rimuovere l'eccesso di PBS dalla superficie dei substrati idrossi-Paam con una bassa corrente di azoto in condizioni sterili. Interrompere la procedura appena alcuna prova di acqua in piedi sulla superficie del gel si osserva. Il gel non deve essere asciugata bene in questa fase.
- Asciugare accuratamente la superficie strutturata di PDMS bollo con un flusso costante di gas azoto ad alta purezza.
- Afferrare il timbro proteina rivestite con una pinza tessuto medicazione e posizionare la superficie strutturata in contatto con la superficie idrogel essiccato. Applicare punti di pressione brevi con la punta delle pinzette sulla parte superiore del timbro PDMS per assicurare un buon contatto tra microfeatures bollo e la superficie idrogel.
- Lasciare il timbro PDMS su the superficie idrogel per 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere delicatamente PDMS francobolli da idrogel idrossi-PAAM con una pinza di tessuto medicazione e seguire il passo 4.1 per pulire il timbro.
- Lavare ampiamente idrogel-PAAM idrossi timbrato da 3 scambi di PBS (pH = 7,4) in condizioni di sterilità per 10 minuti per ogni cambio.
- Optional: Ulteriori microdisegni di altre proteine ECM possono essere aggiunti al-PAAM idrossi superficie seguendo i passaggi 4,5-4,11.
- Zone non stampate passivare con una soluzione sterile di BSA a 5 mg / ml in PBS durante una notte a 4 ° C sotto agitazione delicata su una piastra oscillante.
- Lavare estesamente da 3 scambi di PBS (pH = 7,4) in condizioni di sterilità per 10 minuti per ogni cambio. In questa fase, stampati idrogel-PAAM idrossi possono essere conservati a 4 ° C fino ad una settimana.
5. Deposizione cellulare su micropatterned idrossi-PAAM idrogel
- Incubare coprioggetto in mezzi cella per 30-45 minuti prima di placcatura cells.
- Lavare le cellule aderenti coltivate in un pallone di 75 centimetri 2 coltura con PBS sterile a 37 ° C e staccarlo con 3 ml di tripsina-EDTA o accutase per 10 min.
- Trasferire la quantità desiderata di pre-riscaldato completo terreno di coltura appropriato per la linea cellulare nel pallone contenente le cellule staccate e centrifugare la sospensione cellulare per 3 min a 650 x g.
- Rimuovere il surnatante con una micropipetta e risospendere le cellule in terreno di coltura completo a 15-20.000 cellule / ml.
- Aggiungere 4 ml della soluzione di cellule di un coprioggetto micropatterned (ottenuto dal punto 5.1) e posizionare la cella coprioggetto coperto in un incubatore a 37 ° C e 5% di umidità per 1-2 ore.
- Aspirare delicatamente le cellule senza legami e sostituire il terreno di coltura. Riportare le cellule attaccate alla incubatore e farli diffondono completamente (3-6 ore, a seconda del tipo di cellula).
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Representative Results
Figura 1A presenta la co-polimerizzazione di acrilammide (AAm) e bisacrylamide (bis-AAm) con N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomeri contenenti un ossidrile primario formata da casuale polimerizzazione radicalica una rete idrofila di poliacrilammide con gruppi idrossilici incorporati (idrossi-Paam) . In questo protocollo, un peso di 65 mg di HEA deve essere diluita in un volume di 1 ml di HEPES. Sapendo che la densità di HEA è approssimativamente uguale a uno, assumiamo che si ottiene un volume di lavoro di 1.065 microlitri (HEA + HEPES). Come illustrato nella Tabella 1, l'aggiunta totale di 1.065 ml a 400 ml di AAm e 50 ml di bisAAm porta ad un volume di 1515 ml. Pertanto è necessario un volume di 3485 ml di HEPES per regolare la soluzione ad un volume finale di 5 ml. Come indicato nel punto 2.6, la superficie del vetrino di vetro 22 millimetri deve essere attivato durante 7 minuti in un UV / ozono per rimuoverlo senza causareeventuali danni alla superficie idrogel. Infatti, la superficie di vetro diventa più idrofila dopo l'UV / ozono terapia e può perciò essere facilmente rimosso immergendo l'intero sistema in acqua. Inoltre, il trattamento UV / ozono impedisce la contaminazione chimica del vetrino 22 mm, che è in contatto diretto con la superficie idrogel. Questa tecnica permette di ottenere una superficie piana circolare poliacrilammide (22 mm di diametro) vincolato ad un vetrino coprioggetto (25 mm di diametro).
Come illustrato nella figura 1B, microdisegni di proteine possono essere creati sulla superficie di idrogel idrossi-PAAM da stampa microcontact. In questa procedura sperimentale, esposizioni UV / ozono consentono di ridurre temporaneamente l'idrofobicità intrinseca dei PDMS francobolli formando gruppi silanolici sulla superficie. Infatti, la linea 185 nm produce ozono da ossigeno molecolare mentre la linea 254 nm converte l'ozono in ossigeno atomico. Questa specie reattive attacca i ba silossanicickbone di PDMS per formare ossigeno ricco strato di silice come SiOx e gruppi di superficie Si-OH. La superficie PDMS ossidata si caratterizza per recuperare la sua idrofobicità in poche ore dopo l'esposizione all'aria dovuto alla migrazione di peso molecolare non reticolato catene polimeriche bassa dalla fase bulk alla superficie. Questa strategia consente la diffusione della soluzione proteica sulla superficie del timbro PDMS.
Uno dei principali vantaggi di questo metodo è di modulare indipendente rigidità matrice (Figura 2A), geometria micropattern (Figura 2B), cellule-ligando densità (Figura 2C), e la proteina naturale (Figure 3A e 3B). Come mostrato in Figura 2A, idrogel-idrossi Paam mostrano una dipendenza lineare di moduli elastici sulla concentrazione reticolante da pochi kPa a diverse decine kPa, consentendo la riproduzione fini della rigidità del microambiente cellulare. Figura 2B Figura 2C mostra che la cellula -ligand densità può essere modulata variando la concentrazione della soluzione proteica usato per incubare francobolli PDMS. figura 3 presenta una immagine di fluorescenza di linee collagene stampati attraverso le linee laminina e fibronectina utilizzando stampe microcontact sequenziali.
E 'interessante per i lettori di notare che varie dimensioni e forme di microdisegni sono stati stampati in modo efficiente, indipendentemente dalla rigidità idrogel. Abbiamo riprodotto con successo microfeatures di proteine con spigoli vivi (ad esempio, triangoli e stelle) e dritto (ad esempio, linee), o curve (ad esempio, cerchi) forme, dimostrando che non vi è alcuna majolimitazione r per la complessità del modello. Per esperimento cella singola, la superficie micropattern era tra 400 e 2.500 micron 2, il valore più basso corrispondente al limite di vitalità cellulare unico. Come molti altri metodi basati Microscrittura-, il principale limite del metodo presentato riguarda la risoluzione spaziale. Su idrogel rigidi (E> 10 kPa), la risoluzione spaziale è di circa il micrometro e determinato principalmente dalla risoluzione del timbro, mentre al idrogel "soft", il limite di risoluzione viene in parte determinata dalla deformazione della superficie che possono verificarsi durante l' trasferimento proteina.
La tossicità degli idrogel idrossi-PAAM è stata studiata quantificando la vitalità delle cellule endoteliali primarie placcato per 1, 2, e 3 giorni in coltura in modo omogeneo patinata e microprinted morbide idrogel idrossi-PAAM (Figura 4A). Circa l'80% dei HUVECs placcato su micropatterned morbide idrogel idrossi-PAAM mantenutola loro vitalità per tre giorni, a dimostrazione della biocompatibilità di idrossi-PAAM Idrogel per la coltura cellulare. È interessante notare che, vitalità simile è stato ottenuto nel nostro laboratorio con le cellule neuronali corticali primarie. Inoltre, le cellule endoteliali primarie proliferano più "rigido" (500 kPa) rispetto a (25 kPa) substrati "soft" (Figura 4B), indicando che questo metodo fornisce un microambiente adatto per studiare la proliferazione cellulare in una vasta gamma di rigidità .
Per disaccoppiare l'effetto di substrato rigidità e zona spalmare sul meccanotrasduzione, cellule endoteliali primarie (HUVEC) sono state piastrate su microdisegni FN rivestite rettangolari (zona costante di 1.200 micron 2) depositato su idrossi-PAAM idrogel di tre diverse rigidezze (2.5, 8.5, e 25 kPa). Poi, HUVECs erano macchiati di filamenti di actina, vinculina e DNA seguendo una procedura standard di immunocitochimica, usati per la mammacellule Lian placcato su substrati di vetro. Sulle superfici più morbide, HUVECs presentano densità delle fibre di actina basso e un nucleo arrotondato, mentre su substrati rigidi, fibre di actina sono più dritto e più spesso e il nucleo deformato (figura 5). Variazioni substrato rigidità della struttura un'area diffusione costante modulano la tensione e la distribuzione delle fibre di stress di actina, che si traduce nel rimodellamento del nucleo. Questa osservazione suggerisce un accoppiamento meccanico tra rigidità matrice, citoscheletro, e il nucleo.
| Finale rapporto AAm / bisAAm | AAm 40% (microlitri) | Peso di HEA sciogliere in 1 ml di HEPES (mg) | bis AAm (2%) (Ml) | HEPES (ml) | Modulo di Young (10 3 Pa) |
| 0,2 / 50 0,5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3.485 3.410 3.285 3.035 2.785 | ~ 1.4 ~ 3.6 ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 |
Tabella 1 Preparazione di idrossi-PAAM Idrogel con diverse rigidità. Soluzioni di lavoro per preparare idrogel-idrossi PAAM con rigidità finale da 1.4 a 25 kPa.
Figura 1 (A) acrilamide (AAm, in nero), N, N'-Methylenebisacrylamide (bis-AAm, in blu) e N-hydroxyethylacrylamide (HEA, in rosso) sono stati mescolati insieme per formare idrossi- Idrogel PAAM. (B) Rappresentazione schematica delle varie fasi della procedura micropatterning in idrogel idrossi-PAAM. Una soluzione di proteina è prima incubata per 1 ora sulla faccia di una struttura microstamp (punto # 1). La superficie idrogel viene delicatamente asciugato con un flusso di azoto (punto # 2). Il microstamp viene poi messo in contatto formale con la superficie idrossi-PAAM durante 1 ora (punto 3 #). Dopo lavaggi successivi, la superficie microprinted viene passivato con una soluzione di BSA sterile depositato O / N a 4 ° C (punto # 5) per bloccare aree non stampate. Infine, l'idrossi-PAAM superficie microprinted viene lavato più volte con PBS sterile ed è pronto per la semina delle cellule (punto # 6). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2 (A) L'evoluzione della rigidezza di idrogel-PAAM idrossi è linearmente correlata con la quantità di bis-AAm cross-linker (la linea rossa è una regressione lineare con R 2 = 0,995). Immagini (B) fluorescenza di laminina rettangolare micro-caratteristiche stampati su idrossi-PAAM idrogel di diversa rigidezza (E = 2.5, 15, e 40 kPa). Barre di scala corrispondono a (A) 65 micron, (B) 80 micron, e (C) 50 micron. (C) linee parallele di 15 micron di larghezza forma un gradiente LM in un idrogel 25 kPa idrossi-Paam, come dimostra l'andamento del profilo di intensità di fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Immagine Figura 3 (A) Immunofluorescenza di fibronectina (in rosso) e laminina (in verde) strisce incrociate a 90 °. (B) Multilabeling di fibronectina (in rosso), laminina (in verde) e collagene (in blu) strisce microprinted successivamente su un substrato 25 kPa idrogel PAAM. Barre di scala corrispondono a 30 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 (A) La quantificazione della vitalità cellulare ha dimostrato eccellente sopravvivenza delle cellule a 24, 48, e 72 ore dopo essere stato placcato in modo omogeneo a polvere e micropatterned superfici idrossi-PAAM. Il numero indicato ala parte inferiore di ogni barra corrisponde al numero totale di cellule contate per il saggio vitalità. (B) Quantificazione dei HUVECs proliferazione su 25 e 500 kPa substrati omogeneamente rivestite dopo 1 (barre bianche) e 7 (bar hash) giorni di coltura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 immagini fluorescenti di cellule endoteliali primarie immunostained coltivate su microdisegni FN rivestite rettangolari, che sono stati depositati in idrossi-PAAM idrogel di 2,5 kPa, 8,5 kPa e 25 kPa (da sinistra a destra). Le fibre di stress di actina (in verde ) sono state colorate con Alexa Fluor 488 falloidina, adesioni focali (in rosso) sono state colorate con un polyclo il mouseanticorpo primario nale e marcato con un anticorpo secondario IgG rosso fluorescente e il DNA era macchiato in blu con DAPI. Le barre di scala corrispondono a 17 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Molte osservazioni in vitro nella moderna biologia cellulare sono state eseguite su vetrini rigidi, spesso rivestiti con un sottile strato di proteine ECM o peptidi sintetici contenenti la sequenza RGD. Tuttavia, tali substrati di coltura di base non ricapitolano l'intera complessità fisico-chimiche della ECM e quindi non forniscono un modello accurato per lo studio dei processi meccanotrasduzione cellulari. Per affrontare questo problema, vi proponiamo una semplice alternativa a funzionalizzare idrogel bidimensionali con qualsiasi importo desiderato e la natura delle proteine ECM. Questo metodo permette il controllo indipendente di importanti spunti meccanotrasduzione, quali la rigidità della matrice, la morfologia cellulare e confinamento o densità cellulare-ligando. Inoltre, idrogel idrossi-Paam superare uno dei più grandi limitazioni dei metodi di funzionalizzazione corrente, che è l'incapacità di immobilizzare e controllare la distribuzione spaziale di più di una proteina ECM. A causa della elevata affinità di idroxy-Paam Idrogel per biomolecole, si può controllare la distribuzione spaziale delle varie proteine ECM sulla stessa superficie, indipendentemente dalla rigidità matrice in base microprintings sequenziali, che non richiedono alcuna attrezzatura supplementare.
Proponiamo una nuova procedura basata sulla costituzione di gruppi ossidrilici all'interno di idrogel di acrilamide per superare le loro proprietà intrinsecamente non-adesivi con i requisiti minimi in termini di costi o di competenze. In confronto con le tecniche esistenti per patterning di proteine in idrogel, il metodo di idrossi-PAAM evita l'uso di prodotti chimici tossici (ad esempio, idrato di idrazina), costosi reticolanti fotoreattivi (ad esempio, solfo-Sanpah) e la dipendenza potenza della lampada UV e il posizionamento di funzionalizzare idrogel morbido. Idrogel idrossi-PAAM rimangono stabili e attivi per diverse settimane, possono essere prodotti di massa, facilmente microprinted e la loro elevata affinità per biomolecole permette di indagare gli effetti sinergici diproteine ECM coniugati sulle funzioni cellulari. Inoltre, idrogel idrossi-Paam possono essere utilizzati per studiare quantitativamente la quantità di forze esercitate dalle cellule contrattili sul loro microambiente circostante. Infatti, abbiamo dimostrato precedentemente che 1,20 perline fluorescenti possono essere facilmente incorporati in idrogel idrossi-Paam, al fine di utilizzare cellule forza di trazione microscopia (TFM) per misurare il campo di spostamenti e stimare il campo di trazione risultante esercitata dalle cellule eucariotiche piastrate su microdisegni bidimensionali.
Come molti altri metodi basati microstampa-, il limite principale di idrogel-PAAM idrossi riguarda la risoluzione spaziale di microfeatures proteine. Su idrogel rigidi (E> 10 kPa), la risoluzione spaziale è di circa un micrometro e determinato principalmente dalla risoluzione del timbro, a seconda della tecnica utilizzata litografia per fabbricare lo stampo in silicone. Su idrogel più morbide, la risoluzione spaziale viene in parte determinato da the la deformazione della superficie durante il trasferimento di proteine, che diventa il limite principale per raggiungere micrometro risoluzione spaziale. L'approccio qui presentato è attualmente limitata a substrati bidimensionali. Tuttavia questo metodo è altamente scalabile e ulteriori studi sono attualmente in corso nel nostro laboratorio di estendere questo metodo per strutture tridimensionali.
Speriamo che idrogel idrossi-PAAM possono aiutare a decifrare i meccanismi fondamentali di processi cellulari e tissutali complessi che sono intimamente legati alle proprietà fisico-chimiche del microambiente delle cellule 21,22, compreso lo sviluppo embrionale, risposte infiammatorie, la guarigione delle ferite, crescita dei neuriti, tessuto adulto omeostasi, e la patogenesi di malattie come la fibrosi e cancro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
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