Summary
原代小鼠成骨细胞与维甲酸治疗产生分枝细胞轴承骨细胞的形态学和分子特征的同质人口。该方法克服了获得和保持主骨细胞在培养的难度，并且可以是有利的，研究从转基因模型中的细胞。
Abstract
需要进行骨细胞培养物是众所周知的骨研究者的社区;原发性骨细胞的分离是困难的，产生低细胞数量。因此，在最广泛使用的蜂窝系统是骨细胞样MLO-Y4细胞系。
这里描述的方法是指利用视黄酸生成支链的细胞形态学和分子骨细胞功能的均质群体。
来自小鼠颅盖骨的成骨细胞的分离后，全反式维甲酸（ATRA）加入到细胞培养基中，细胞监测在倒置显微镜下每天进行。第一形态的变化是可检测后第2天治疗和分化的一般是完整的5天，用树突，以产生细胞外基质的能力丧失，下调成骨细胞标志物和逐步发展上调骨细胞特异性分子。
内容“>日小区监控是必要的，因为初级细胞的固有变异性，并且该协议可以适于与变化最小，以从不同的小鼠品系得到，并应用到转基因模型中的细胞。该方法易于进行，且不需要特殊的仪器，它是高度可重复的，并迅速产生一个成熟的骨细胞种群中完全不存在的细胞外基质，允许使用这些细胞的无限生物学应用。
Introduction
骨细胞，最丰富的骨细胞类型，是终末分化，高度分枝细胞深部的骨架内。成熟的骨细胞的细胞体都包含在骨陷窝，并有不同的形状;骨细胞与细长的细胞体存在于皮质骨，而圆形骨细胞更频繁的骨小梁1。树突分支从细胞体延伸，居住在狭小的通道，称为泪小管，形成一个复杂的网络，使多个联系人不仅与其他骨细胞，也可以与其他骨细胞类型，骨髓，血液和血管周细胞相关。通过包含在陷窝及小管间质液，骨细胞也最终连接到循环系统，因此，他们可以影响不仅本地而且系统性事件，反之亦然他们的行为可以通过局部和全身变化2进行调节。
该骨细胞的研究最近势头，得益于几个技术进步，如产生组织和细胞特异性的转基因动物，利用强大的显微镜技术和高通量分子筛选3,4。然而，这些细胞的知识仍然是不完整的，主要是由于足够的体外模型的相对稀缺性。实际上，骨细胞一直总是很难获得，因为在深的位置，并在培养维持和增殖为特征的这种分化的细胞类型的低水平。
沿着这些年来，已经开发了许多方法来分离主骨细胞5-7，尽管它们通常产生低细胞产量和携带，即使一些污染性的成纤维细胞将迅速长满骨细胞8的风险。由于这个原因，大多数实验在体外的工作已经进行迄今在行之有效的骨细胞细胞升国家统计局MLO-Y4 9。
额外的体外方法可提高研究这些细胞的可能性，并能改善骨细胞生物学和生理学的分析。被大量采用，这样的方法应该可以很容易地复制，并且不需要特殊的仪器或非常长的时间，以达到细胞成熟。重要的是，如果适用于原代细胞，它们将使得有可能采取的转基因动物的优势。最近，我们描述了治疗与视黄酸主要的成骨细胞和成骨细胞株MC3T3-E1的诱导快速的表型变化，导致支链的细胞骨轴承10的形态学和分子特征的均匀种群的发展。
全反式维甲酸（ATRA）是维生素A的活性代谢产物，通过结合核维甲酸受体（维甲酸受体）调节基因转录。维甲酸受体与DNA结合的异源二聚体与类视黄醇X受体（RXR的），最终导致视黄酸（RA）响应性的靶基因11的调制。全反式维甲酸已经显示调节分化几种类型细胞的分化和成熟，其中其它支链的细胞，如神经元细胞12和足细胞13。
这里所描述的方法是基于除了ATRA的初级成骨细胞。是有效的，全反式维甲酸具有对细胞接种在限定的密度准确成熟阶段加入;在我们的经验，这些条件是至关重要的，以获得表型转化的成骨细胞向骨细胞。
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Protocol
所有动物实验均根据国家和有关用于科学目的，并审查和批准米兰大学的伦理委员会动物保护欧洲现行法规执行。
1，分离成骨细胞的
该方法中，用小的修改，如下通过多迪格等[14]描述的过程。
- 制备消化培养基中，加入0.1％胶原酶P和0.05％的胰蛋白酶（2.5％胰蛋白酶10X，无酚红的开始），以HBSS培养基（Hanks平衡盐溶液，无钙，镁，或酚红）。
- 使用3-4日龄小鼠（该过程可以适用于少至1小鼠）。
- 斩首牺牲。喷雾头，用70％乙醇，并保持在冰上。用镊子和解剖/手术剪刀去除皮肤和肌肉层。
- 轻轻取出顶骨和由以下两半矢状缝将它们分开。确保骨骼是自由缝线和任何附着的组织，并把各个骨片在含有HBSS介质中，直到程序完成孔板。
- 丢弃的HBSS，并加入到各孔中，在37℃下消化培养基15分钟
- 弃上清。
- 再加入37℃的培养基中消化15分钟
- 此时保存的上清液，并将其放置在补充有10％FBS（胎牛血清）和1％链霉素/青霉素的α-MEM（最低必需培养基）。
- 重复步骤1.7和1.8倍。
- 通过在425 g离心5分钟集中三个收集到的馏分，旋细胞，弃去上清液，加3辅以α-MEM毫升重悬细胞沉淀，并转移到25 平方厘米烧瓶中。
- 24小时后，改变介质以去除碎片和死细胞。
- 加50微克/毫升抗坏血酸（AA）和3mM的甘氨酸cerol 2 - 磷酸二钠水合物（GP）的α-MEM培养基。
- 此后，改变培养基（α-MEM加AA / GP）每隔一天。
2，全反式维甲酸协议
- 进行所有的实验用全反式维甲酸（全反式维甲酸）在一个黑暗的房间，以防止失活。
- 准备在HBSS介质的1X胰蛋白酶溶液，保持在37℃直到使用。
- 从会合细胞中取出介质，并小心地用HBSS冲洗。
- 加入1 ml胰蛋白酶，轻轻地旋转烧瓶，以便进行覆盖，通过胰蛋白酶的所有细胞中，孵育3分钟，在37℃下
- 检查电池的实际脱离倒置显微镜下。
- 加3毫升的α-MEM培养基的灭活胰蛋白酶。
- 回收细胞，并离心15分钟，在425克
- 重新悬浮于新鲜培养基中的细胞沉淀。
- 将用血球计数板的下降，使解决几分钟，算上CELL号。
- 位置细胞中为25cm 2培养瓶中以10,000细胞/ cm 2与α-MEM加上AA / GP的密度。要知道，细胞密度是相关的细胞过程和细胞间接触的最佳发展。一个出发密度高于10,000个细胞/ cm 2的损害细胞过程的正常发展，但较低的手机号码导致过早的细胞死亡，由于缺乏细胞间的联系。
- 添加5微米全反式维甲酸对介质每隔24小时。
- 监测细胞每天以评估形态：形态变化48小时后，一般观察。如果，第一24-48小时后，细胞仍然增殖，replate在上述密度。后4-5天成熟骨细胞的同质人口存在。根据需要，使用细胞在任何时间点，最多12-15天。
- 当细胞接种于其他支持（如盖玻片或孔板），请确保上述密度维持和继续添加全反式维甲酸，每24小时待用。离开细胞粘附于至少24小时的新的支持实验前。
3，免疫染色
- 对于免疫染色，镀上盖玻片的细胞，并按照既定方法（例如参见巴里15）。
- 例如，用于间接免疫荧光法，固定于4％多聚甲醛或冷丙酮，与第一抗体于室温1小时，在湿盒中温育顺序，然后在黑暗中的次级荧光标记抗体，在室温下30分钟后，在湿盒。
- 使用DAPI或类似物的核复染，并在抗褪色介质装载。
4，茜素红染色和提取
- 板盖玻片上的细胞。
- 通过浸入盖玻片在70％乙醇中10分钟，固定细胞。
- 覆盖细胞用茜素红染色溶液几滴（1毫克/毫升，pH 5.5）中为30分钟。
- 用自来水冲洗盖玻片。安装与甘油在载玻片上滴，并使用正置显微镜在10X和20X的放大倍率拍摄图像。
- 上述步骤后，通过浸渍在自来水中的幻灯片中恢复的盖玻片。
- 把每个盖玻片在孔板。
- 添加60％高氯酸（量要足够完全覆盖细胞）和离开O / N，在4℃下缓慢搅拌。
- 读出的上清液的光密度用分光光度法在450nm波长的光。
- 正常化为细胞数的值，加健那绿（在PBS中的0.2％的溶液），以覆盖所述细胞制剂10分钟。
- 用超纯水仔细洗净。
- 加入0.5当量盐酸（数量要足够覆盖所有的细胞），并用手轻轻摇晃几秒钟。
- 分光光度法读取吸光度在615nm。
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Representative Results
得到的结果是5〜10个独立的实验。
细胞形态
AA / GP治疗原发性细胞具有多鹅卵石样的功能，成熟的成骨细胞的特性。穿插分枝状细胞（红色箭头， 如图1A所示），可以发现，这可能代表了一些骨细胞。
全反式维甲酸治疗，细胞迅速开始显示后果，其中后2天，一般观察。 如图1B所示 ，支链的细胞需要空间来扩展他们的树突。与全反式维甲酸进行治疗，后果逐步在数量和复杂性的增加， 图1C和1D。丝状肌动蛋白由罗丹明标记鬼笔环肽染色突出的细胞过程，这是由鬼笔环肽， 图2中标记的。
基质生产
<P类=“jove_content”>成骨细胞产生大量的钙化基质，其中积累了与细胞之间，并且可以通过茜素红染色， 图3A可视化的。骨细胞不产生钙化的细胞外基质，与茜素红染色结果负完全在全反式维甲酸培养细胞， 图3B。因此，没有茜素红或最小量可提取步骤， 图3C后进行测定。骨细胞标记和产品
硬化蛋白是由全反式维甲酸治疗的细胞中表达， 如图4所示 。免疫组化染色显示强烈的细胞质表达和积极点的存在以及细胞过程。通过免疫荧光，强大的FGF23阳性是可检测在ATRA处理的细胞， 图5中，无论是在细胞体或沿细胞过程。
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图1：光镜。成骨细胞显示经过5天的潜伏期为AA / GP（A）（比例尺为100μm）一个主要的立方形外观。稀疏的网状细胞可以识别（A）（箭头）。经过2天的治疗全反式维甲酸（B）（比例尺为100μm）的，细胞显示出更加细长的形状和树突出现清楚地检测到。只有arborized细胞可5天后孵化全反式维甲酸（C）（比例尺为100μm）的观察，并更好地检测到在更高的放大倍率（D）（比例尺50微米）。
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图2。肌动蛋白丝的染色。肌动蛋白丝被确定罗丹明falloidin染色。下图显示了与全反式维甲酸治疗3天细胞中获得具有代表性的结果。已经在这个时间点，丝状肌动蛋白显示为显影单元的过程的一个主要部分。比例尺：50微米。
图3。钙化沉积。茜素红染色成骨细胞中观察到弥漫经过5天的潜伏期为AA / GP（A）（比例尺100微米），而为负的全反式维甲酸培养细胞（B）（比例尺50微米）。深刻的差异可以通过SPECT测量roscopy提取茜素（C）之后。
图4。硬化蛋白。硬化蛋白阳性是在细胞质和细胞一起孵育ATRA（比例尺为50μm）的细胞过程中检测到。
图5。FGF23，FGF23免疫激烈的全反式维甲酸治疗的细胞（比例尺50微米）。
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Discussion
在过去几年中的骨细胞已成为在骨中最核心的细胞。研究进展，正逐步显露出一些以前没有料到的或未经证实的骨细胞特性，这是巨大的价值，新颖的设计和更好的治疗各种骨疾病。然而，骨细胞生物学的研究已患体外模型的有限到这样的程度，成骨细胞已被用来作为替代细胞经过一段长时间的骨细胞样细胞系MLO-Y4被提供之前。最近，条件永生化细胞系是由同一组16，它可以分化成分枝后期骨细胞表达硬化蛋白与FGF23介绍。虽然这些细胞系的极值是没有根据的问题，这是众所周知的原代细胞更类似于体内情况，并提供了可能性，获得初级骨细胞FROM转基因动物来执行特定的分子通路的功能研究。
隔离和初级骨细胞，从鸡骨头5,6和随后从大鼠和小鼠的骨骼17,7首次获得的文化，是非常有用的，但它们的隔离只产生少量的每个过程的细胞和细胞纯度依赖在很大程度上个人专长。因此，该方法目前仅由实验室有限数目的使用。
其他研究小组已经通过在三维矿化基质18,19，构成一个更加生理环境，但阻碍后续的研究应用渐进嵌入诱导成骨细胞的终末分化得到的成熟骨细胞。这是事实，基质矿化20，以及低氧分压21，是骨细胞成熟的生理触发器。然而，遇见hodology避免这两个条件可以提高可行性和延长使用的细胞。我们提出的方法10，它由加入视黄酸对成骨细胞成熟的，具有简单，高重现性好，避免了细胞转染22或使用昂贵的生长因子23。
随着一系列的预实验，我们确定了初始细胞数是关键的一步，调理正常形成多个树突和细胞间的接触。过高的电镀细胞密度影响的复杂性和扩展细胞的过程中，而过低的数字导致细胞间粘连的损失，导致细胞的痛苦和死亡。
重要的是，调整ATRA剂量和每日监测细胞形态的强烈建议，因为这可能会影响到全反式维甲酸的敏感性原代细胞的固有变异性。这些方面可以成为特别重要磨片n个方法应用于转基因模型。
细胞过程的开发可以通过肌动蛋白染色进行监控，因为枝晶中含有丰富的丝状肌动蛋白。
这是众所周知的骨细胞不产生钙化基质，全反式维甲酸和孵化迅速废除它，如通过逐步减少直至茜素红染色完全消极。同时，ATRA诱导的众所周知的骨细胞标志物，最显着硬化蛋白24的表达，并确保生产FGF23，参与骨和全身磷酸盐处理25的一个基本生长因子。因此，进一步研究旨在探讨FGF23和硬化蛋白在骨细胞的功能作用会被内源性产生这些分子提供便利。
总之，我们表明，用视黄酸处理生成从主颅盖细胞成熟骨细胞的均质群体，该refore允许从野生型和转基因动物简单，迅速地制备骨细胞。与其他方法相比，我们的协议似乎呈现几大优势，主要是简单的应用程序和高重现性。骨细胞成熟过程可在细胞中的足够数量的，从最初的进程，通过发生在一个5天的帧的几个步骤扩频进行研究。作为另一个优点，成熟的骨细胞在完全缺乏周围矿化基质的获得，允许无限制的分子和功能分析中的应用。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
资金由“波捷特一个concorso基金会IRCCS Ospedale Maggiore的Policlinico的2009至2010年”，以医师和的Associazione巴比诺Nefropatico荷兰ONLUS，米兰提供
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
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