Summary
Лечение первичных остеобластов мыши с ретиноевой кислоты производит гомогенную популяцию разветвленных клеток, несущих морфологические и молекулярные особенности остеоцитов. Способ преодолевает трудность получения и сохранения первичных остеоцитов в культуре, и может быть выгодным для изучения клетки, полученные из трансгенных моделей.
Abstract
Необходимость остеоцитарного культур хорошо известно в сообщество исследователей кости; изоляция первичной остеоцитов трудно и производит небольшое число клеток. Таким образом, наиболее широко используется система сотовой связи является остеоцит, как MLO-Y4 клеточной линии.
Способ здесь описано относится к использованию ретиноевой кислотой с образованием гомогенной популяции клеток с разветвленными морфологических и молекулярных особенностей остеоцитарного.
После выделения остеобластов из свода черепа мыши, полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) добавляют к клеточной среде, а также мониторинг соты выполняется ежедневно под инвертированным микроскопом. Первые морфологические изменения обнаруживаются после 2 дней лечения и дифференциации обычно завершается в течение 5 дней, с прогрессивного развития дендритов, потеря способности производить внеклеточный матрикс, понижающей регуляции остеобластов маркеров и до регулирования остеоцитарного конкретных молекул.
Содержание "> Мониторинг Ежедневно клеток необходим из-за присущего изменчивости первичных клеток, и протокол может быть адаптирован с минимальным изменением в клетках, полученных из различных линий мышей и применяемых к трансгенных моделей.Метод прост для выполнения и не требует специального оборудования, это очень воспроизводимые, и быстро генерирует зрелого населения остеоцитарного в полном отсутствии внеклеточного матрикса, что позволяет использовать эти клетки для неограниченного биологических применений.
Introduction
Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, неизлечимо дифференцированной, очень разветвленные клетки глубоко расположенные в скелете. Тело клетки зрелой остеоцитов содержатся в костном лакун и имеют различные формы; остеоцитов с удлиненных тел клеток находятся в кортикальной кости, в то время как закругленные остеоцитов становятся все более частыми в губчатой кости 1. Разветвленные дендриты простираются от тела клетки и проживать в крошечных каналов называемых канальцы, образуя запутанную сеть, которая делает несколько контактов не только с другими остеоцитов, но и с другими типами костных клеток, костного мозга, кровеносных сосудов и связанных с ними перицитами. Через межклеточной жидкости, содержащейся в лакун и канальцев, остеоциты также в конечном счете, подключен к системе циркуляции, поэтому они могут влиять не только местные, но и системные события, и наоборот их поведение может регулироваться как местных, так и системных изменений 2.
Изучение остеоцитов недавно набрала обороты, благодаря несколько технических достижений, таких как генерации ткани и клеточных конкретных трансгенных животных, использование мощных методов микроскопии и высокой пропускной молекулярной скрининга 3,4. Тем не менее, знание этих клеток еще не завершен, в основном за счет относительного дефицита адекватной в пробирке моделей. На самом деле, остеоциты были всегда трудно получить и поддерживать в культуре из-за глубокого расположения, и низкий уровень пролиферации, которая характеризует такой дифференцированный тип клеток.
Вдоль лет, ряд методов были разработаны, чтобы изолировать первичный остеоцитов 5-7, хотя они обычно производят урожаи низкие клеток и несут риск, что даже несколько загрязняющих фибробласты быстро перерастают остеоцитов 8. По этой причине, самый экспериментальный в пробирке работы было проведено до сих пор на устоявшихся остеоцитов клеток лНИС MLO-Y4 9.
Дополнительные методологии в пробирке может повысить возможность изучения этих клеток и может улучшить анализ остеоцитарного биологии и патофизиологии. Чтобы быть в значительной степени приняты, такие методы должны быть легко воспроизвести, и не потребует специальных инструментов или очень длинные раза до клеток созревание. Важно отметить, что если применимо к первичных клеток, они дают возможность использовать преимущества трансгенных животных. Мы недавно описали, что обработка остеобластов линии клеток MC3T3-E1 и первичных остеобластов с ретиноевой кислоты вызывает быстрое изменение фенотипа, ведущий к развитию гомогенной популяции клеток, несущих разветвленных морфологические и молекулярные особенности остеоцитами 10.
Полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) является активным продуктом метаболической трансформации витамина А, который регулирует транскрипцию генов путем связывания ядерных рецепторов ретиноевой кислоты (РАКС). RARsсвязываются с ДНК, как гетеродимеров с ретиноидных X рецепторов (RXRs), в конечном итоге приводит к модуляции ретиноевой кислоты (RA)-отзывчивым генов-мишеней 11. ATRA, как было показано модулировать дифференцировку и созревание нескольких типов клеток, в том числе другие разветвленные клетки, такие как нервные клетки 12 и подоцитах 13.
Способ здесь описано основана на добавлении к ATRA первичных остеобластов. Чтобы быть эффективной, ATRA должен быть добавлен в точном стадии созревания на клетки высевали при определенной плотности; в нашем опыте эти условия имеют решающее значение для получения переключатель фенотип от остеобластов к остеоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с национальным и европейским действующих норм, касающихся защиты животных, используемых для научных целей и были рассмотрены и одобрены комитетом по этике Миланского университета.
1. Выделение первичных остеобластов
Метод, с небольшим изменением, в соответствии с процедурой, описанной Додиг и др. 14.
- Подготовка переваривание среды, путем добавления 0,1% коллагеназы P и 0,05% Трипсин (начиная с 2,5% трипсина 10X, не фенолового красного) в HBSS среды (Hanks Balanced Salt Solution, не кальций, магний, или фенола красного).
- Использование 3-4 день старых мышей (процедура может быть применена к всего лишь 1 мыши).
- Жертвоприношение путем обезглавливания. Спрей голову с 70% этанола и держать на льду. Удалить кожу и мышечные слои пинцетом и рассекая / хирургическими ножницами.
- Аккуратно удалите теменной кости иотделить их, следуя стреловидного шва в двух половинок. Убедитесь, что кости были свободны от швов и любой приверженец ткани и поместите отдельные части кости в хорошо планшеты, содержащие HBSS среду пока процедура не будет завершена.
- Отменить HBSS и добавить в каждую лунку переваривания среда в течение 15 мин при 37 ° С
- Удалите супернатант.
- Добавить вновь переваривая среды в течение 15 мин при 37 ° С.
- На этот раз сохранить супернатант и поместить его в альфа-MEM (минимальной основной среде), дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1% стрептомицина / пенициллину.
- Повторите шаги 1,7 и 1,8 2x.
- Бассейн три собранных фракций, вращение клетки центрифугированием при 425 г в течение 5 мин, отбросить супернатант, добавляют 3 мл дополнен альфа-МЕМ с ресуспендируют осадок клеток, и перевод в 25 см 2 колбы.
- Измените среду после 24 часов для удаления мусора и мертвых клеток.
- Добавить 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты (AA) и 3 мм Glycerol 2-фосфат динатриевой соли гидрат (GP) в среде альфа-МЕМ.
- После этого изменения среды (альфа-MEM плюс AA / GP) через день.
2. ATRA протокол
- Провести все эксперименты с ATRA (All-транс-ретиноевой кислоты) в затемненной комнате, чтобы предотвратить инактивации.
- Подготовка раствора трипсина 1X в HBSS среды и держать при 37 ° С до использования.
- Снимите среды из субконфлюентных клеток и тщательно промойте их HBSS.
- Добавить 1 мл трипсина, осторожно вращать колбу, чтобы все клетки должны быть охвачены трипсина и инкубировали в течение 3 мин при 37 ° С.
- Проверьте фактического отряда клеток под инвертированным микроскопом.
- Добавьте 3 мл альфа-MEM среде для инактивации трипсина.
- Восстановление клеток и центрифугируют в течение 15 мин при 425 г.
- Ресуспендируют осадок клеток в свежей среде.
- Наведите падение счетной гемоцитометр камеры, дают отстояться в течение нескольких минут и подсчитать сеLL число.
- Место клеток в 25 см 2 колбы при плотности 10000 клеток / см 2 с альфа-MEM плюс AA / GP. Знайте, что плотность клеток имеет отношение к оптимального развития клеточных процессов и межклеточных контактов. Отправной плотность выше, чем 10000 клеток / см 2 ухудшает надлежащее развитие клеточных процессов, но более низкие количества клеток приводит к преждевременной гибели клеток, в связи с отсутствием межклеточных контактов.
- Добавить 5 мкм ATRA в среду каждые 24 часа.
- Монитор клетки ежедневно оценивать морфологию: морфологические изменения, как правило, наблюдается после 48 часов. Если после первых 24-48 часов, клетки все еще пролиферирующих, replate по указанному выше плотности. Однородная население зрелого остеоцитов присутствует через 4-5 дней. В зависимости от потребностей, использовать клетки в любой момент времени, до 12-15 дней.
- Когда клетки высевают на других опорах (например, покровные или хорошо пластин), убедитесь, что выше плотность поддерживается иПродолжайте добавлять ATRA каждые 24 ч до использования. Оставьте клетки прилипать к новой поддержкой по меньшей мере 24 ч до начала эксперимента.
3. Иммуноокрашивание
- Для иммуноокрашивания, пластины клеток на покровных и следовать установленным методологии (см., например, Барри 15).
- Например, для непрямой иммунофлуоресценции, фиксируют в 4% параформальдегида или холодным ацетоном, последовательно инкубируют с первичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа в увлажненной камере, а затем с вторичной флуоресцентной-меченого антитела в темноте, при комнатной температуре в течение 30 мин, в увлажненной камере.
- Используйте DAPI или аналогов для ядерной контрастного, и смонтировать в борьбе с выцветания среднего.
4. Ализарин Красный Окрашивание и Добыча
- Пластина клеток на покровные.
- Фиксации клеток путем погружения покровное в 70% этаноле в течение 10 мин.
- Обложка клеток с несколькими каплями ализарином решения красный окрашивания (1 мг / мл, рН 5,5)в течение 30 мин.
- Вымойте покровные с водопроводной водой. Установите с каплей глицерина на стеклах и получать изображения с использованием прямой микроскоп в 10 раз и 20-кратным увеличением.
- После описанной выше процедуры, восстановление покровные погружением слайдов в водопроводной воде.
- Поместите каждый покровное в луночного планшета.
- Добавить 60% хлорной кислоты (количество должно быть достаточно, чтобы полностью покрыть клетки) и оставить O / N при 4 ° С при осторожном перемешивании.
- Считать оптическую плотность надосадочной жидкости спектрофотометрически при длине волны 450 нм.
- Для нормализации значений числа клеток, добавьте Janus Green (0,2% раствор в PBS), чтобы покрыть клеточный препарат в течение 10 мин.
- Вымойте тщательно сверхчистой водой.
- Добавить 0,5 HCl (количество должно быть достаточно, чтобы покрыть все клетки) и слегка встряхнуть рукой в течение нескольких секунд.
- Считайте абсорбцию при 615 нм с помощью спектрофотометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты были получены от 5 до 10 независимых экспериментов.
Морфология клеток
А.А. / GP обработаны первичные клетки имеют в основном булыжником, как черты, характерные для зрелых остеобластов. Перемежаются разветвленные клетки (как указано красными стрелками на рисунке 1а) можно найти, что, вероятно, представляют собой некоторые остеоцитов.
При лечении ATRA, клетки быстро начать показ последствия, которые обычно наблюдаются через 2 дня. Как показано на фиг.1В, разветвленные клетки требуют пространства для расширения своих дендритов. Как лечения с ATRA доходов, последствия постепенно увеличиваются в числе и сложности, рис 1В и 1Г. Окрашивание нитчатых актина по родамина меченных фаллоидином подчеркивает клеточные процессы, которые обозначены на фаллоидином, рисунке 2.
Матрица Производство
<р = класса "jove_content"> Первичные остеобласты производят большое количество кальцинированная матрицы, который накапливается в течение и среди клеток и могут быть визуализированы ализарином красный окрашивание, Фигурное 3A. Остеоциты не производят кальцинированная внеклеточный матрикс, и результаты ализарин красный окрашивания полностью отрицательные в ATRA-инкубируемых клеток, фиг.3В. Соответственно, ни один или минимальное количество ализарином красным не может быть измерена после процедуры экстракции, фиг.3С.Остеоцитарного Маркеры и продукты
Sclerostin выражается ATRA-обработанных клеток, на рисунке 4. Иммуноокрашивание показывает интенсивную цитоплазматической экспрессии и наличие положительных точек вдоль клеточных процессов. По иммунофлюоресценции, сильный FGF23 положительность обнаруживается в ATRA-обработанных клеток, фиг.5, либо в теле клетки или вдоль клеточных процессов.
er.within страницах = "всегда"> 
Рисунок 1. Световой микроскопии. Первичные остеобласты показывают преобладающее шестигранника внешний вид после 5 дней инкубации с AA / GP (A) (масштаб бар 100 мкм). Редкие разветвленные клетки могут быть идентифицированы (А) (стрелки). После 2 дней лечения ATRA (B) (масштабная линейка 100 мкм), клетки отображать более вытянутую форму и дендриты появляются четко прощупывается. Только arborized клетки можно наблюдать после 5 дней ATRA инкубации (C) (масштаб бар 100 мкм), и лучше обнаружить при большем увеличении (D) (масштаб бар 50 мкм).
JPG "Первоначально" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
Окрашивание нити Рисунок 2. Актина. Актиновые филаменты идентифицируются Родамин-falloidin окрашивания. На рисунке показан репрезентативный результат, полученный из клеток, обработанных ATRA в течение 3 дней. Уже в этот момент времени, нитчатые актина появляется в качестве основного компонента разработки процессы в клетке. Шкала бар: 50 мкм.
Рисунок 3. Кальцифицированные отложений. Красный окрашивание Ализарин диффузно наблюдаемые в остеобластов после 5 дней инкубации с AA / GP (A) (масштаб бар 100 мкм), тогда как отрицательное в ATRA-инкубированных клеток (B) (масштабную линейку 50 мкм). Глубокое различие может быть измерена ОФЭКТroscopy после экстракции ализарин (С).
Рисунок 4. Sclerostin. Sclerostin положительность обнаруживается в цитоплазме и вдоль клеточных процессов клеток, инкубированных с ATRA (масштаб бар 50 мкм).
Рисунок 5. FGF23. FGF23 иммуноокрашивание интенсивна в ATRA-обработанных клеток (масштаб бар 50 мкм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы остеоцитов стала самой центральной ячейки в кости. Научно-исследовательские достижения постепенно выявить ряд ранее непредвиденных или недоказанных свойств остеоцитарного, которые имеют огромное значение для проектирования новых и лучшее лечение для различных костных заболеваний. Тем не менее, исследование остеоцитарного биологии страдает от ограниченной доступности моделей в пробирке до такой степени, что остеобласты были использованы в качестве суррогатных клеток в течение длительного периода, прежде чем остеоцитов, как клеточная линия MLO-Y4 был предоставлен. Совсем недавно, условно увековечены клеточная линия была введена той же группой 16, который может быть дифференцированной в разветвленное поздно остеоцитов выражая sclerostin и FGF23. Хотя экстремальное значение этих клеточных линий не под вопросом, это очень хорошо известно, что первичные клетки напоминают больше в естественных условиях ситуацию в и предлагают возможность получить первичную остеоцитов фрOM трансгенные животные для выполнения функциональных исследований по конкретным молекулярных путей.
Выделение и культивирование первичных остеоцитами, сначала полученных из куриных костей 5,6, а затем из крыс и мышей кости 17,7, чрезвычайно полезны, но их изоляция генерирует только небольшое количество клеток на процедуры, и чистота клеток зависит в значительной степени от индивидуального опыта. Таким образом, способ в настоящее время используется только на ограниченном числе лабораторий.
Другие исследовательские группы получили зрелые остеоцитов по индукции конечной дифференцировки остеобластов путем постепенной вложения в трехмерных минерализованных матриц 18,19, которые составляют более физиологическую среду, но являются препятствием для последующих научных приложений. Это правда, что матрица минерализация 20, а также низкий уровень напряженности 21 кислорода, являются физиологическими триггеры остеоцитарного созревания. Тем не менее, встретилисьhodology избегая этих двух условий может привести к увеличению возможности и расширить использование клеток. Предлагаемый метод 10, который состоит из добавления ретиноевой кислоты, чтобы созреть остеобласты, просто, легко воспроизводимым, и избегает трансфекции клеток 22 или использование дорогих факторов роста 23.
С серии предварительных экспериментов, мы определили, что стартовый номер ячейки является важным шагом, кондиционирование собственно формирование нескольких дендритов и межклеточных контактов. Слишком высокая плотность покрытия ячейки влияет на сложность и расширение клеточных процессов, в то время как слишком низкое число привести к потере межклеточных спаек, что приводит к клеточной страданий и смерти.
Важно отметить, что регулировка ATRA дозировки и ежедневного мониторинга морфологии клеток, мы настоятельно рекомендуем, из-за присущего изменчивости первичных клеток, которые могут повлиять на чувствительность к ATRA. Эти аспекты могут стать особенно актуальным Wheн методология применяется к трансгенных моделей.
Развитие клеточных процессов можно контролировать с помощью окрашивания актина, потому что дендриты богаты нитчатых актина.
Хорошо известно, что остеоцитами не производят кальцинированная матрицу, и ATRA инкубации быстро уничтожает его, как показано на постепенное уменьшение до полного негатива ализарина красной окраски. Между тем, ATRA индуцирует экспрессию известных остеоцитарного маркеров, особенно sclerostin 24, и обеспечивает получение FGF23, основополагающего фактора роста, участвующих в кости и системной обработки фосфатом 25. Таким образом, дальнейшие исследования, направленные на изучение функциональной роли FGF23 и sclerostin в остеоцитов будет способствовать эндогенного производства этих молекул.
Таким образом, мы показываем, что лечение с ретиноевой кислоты генерирует гомогенную популяцию зрелых остеоцитов из первичных клеток свода черепа,refore обеспечивает простую и быструю подготовку остеоцитами как от дикого типа и трансгенных животных. По сравнению с другими методами, наш протокол, кажется, представляет ряд преимуществ, в первую очередь простое приложение и высокую воспроизводимость. Процесс остеоцитарного созревания могут быть изучены в достаточном количестве клеток от первоначального распространения процессов через несколько шагов, которые происходят в 5-дневный раме. В качестве дополнительного преимущества, зрелые остеоцитами получены в полном отсутствии окружающий минерализованной матрицы, что позволяет применение неограниченных молекулярных и функциональных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено "Progetto Concorso Fondazione IRCCS Оспедале Маджоре Поликлинико 2009-2010", чтобы доктор медицинских наук, и Associazione Bambino Nefropatico ABN Онлус, Милан
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J.
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
