皮质的interneurons的亚型选择性电穿孔

Summary

该程序展示了如何通过子宫内电穿孔来靶向发育中的小鼠前脑中的中间神经元。该技术对于在注定于皮层表层的中间神经元亚型中实现选择性基因表达特别有效。

Abstract

中枢神经系统（CNS）的成熟的研究依赖于神经元群体的遗传定位。然而，限制所关心的特定的神经元亚型的基因的表达的任务已被证明非常困难，因为特异性的启动子元件的相对稀缺。 GABAergic中间神经元构成的神经元群具有丰富的遗传和形态多样性。事实上，超过11种不同的GABAergic中间神经元亚型已被鉴定在小鼠皮质^1。在这里，我们提出了一个适应协议GABA能居的选择性目标。我们通过使用同源的转录增强子元件来实现GABAergic中间神经元亚型选择性靶向因子DLX5和Dlx6，果蝇远侧少（DLL）基因^2,3的同系物，通过以驱动特定基因的表达， 在子宫内的电穿孔。

Introduction

从命名的内侧和尾神经节隆起（MGE和专家咨询小组，分别）2瞬态胚胎结构的皮质GABAergic中间神经元的散装起源^4。小白蛋白和生长抑素表达的interneurons起源于梅兰日兰，而钙结合蛋白（CR），Vasointestinal肽（VIP）和络丝（RE）表达的interneurons从专家咨询小组发起。这些interneuron亚型可以通过他们的出生日期来区分。梅兰日兰派生亚型胚胎9.5天（E9.5）和E16.5 ^5,6间出生。相比之下，CGE衍生的interneurons从出生E12.5 E18.5，通过与他们的生产高峰在E15.5 ^6。这么晚出生人口的遗传定位，但是，仍然遥遥无期。

鼠远侧少（DLX）基因只表达在显影腹侧前脑^3。 GABAergic中间神经元及纹状体投射神经元，但不皮质锥体细胞表达Dlx1，2,5，和6个基因在早期发育阶段^3。事实上，DLX基因被表达在MGE和CGE脑室下区（SVZ）内所有的GABA能祖细胞。这些基因的表达成为限制在有丝分裂后期阶段^7-9选择亚型。先前的实验证据表明，DLX5 / 6增强子元件允许GABA能系在转基因小鼠模型²的选择性靶向。我们测试使用在附加型表达在发育中的小鼠大脑中的上下文这些增强子元件中的一个的....

Protocol

所有的动物都按照医学纽约大学的机构动物照顾及使用委员会的规例和指引处理。

品系小鼠
由TACONIC提供瑞士韦伯斯特雌性小鼠用于这些实验。为了特异性靶向表面层的interneurons，E15.5胚胎被使用。

注意:该作品（DLX5 / 6.eGFP质粒3微克/微升），使用标准的克隆技术生成中使用的质粒。 绿色荧光蛋白的cDNA克隆到DLX5 / 6-p最小-聚腺苷酸质粒。该质粒可应要求提供（demarn02@nyumc.org）。

1，准备显微注射移液器

1. 将牵引热火＃2到860。
2. 放置并固定在附近的长丝玻璃毛细管。检查该移液管的外径（OD）为约30微米。
3. 按"拉"按钮。
4. 小心地取出毛细管。底部的部分是针。弃顶部。

2，麻醉过程

1. 准备一个含有异氟醚室。注:异氟醚是首选的麻醉剂，由于其快速的行动和副作用发生率低。苯巴比妥是另一种选择;然而，这种药物的耐受性是可变的，并可能导致死亡率比异氟烷更高。
2. 在0.5-1升/分钟O ₂的设置异氟醚4-5％的流量。
3. 确保阀的腔室是打开的，而阀的头部适配器....

Results

我们适应了在子宫内电穿孔技术来实现细胞类型特异性成熟神经元的目标。来驱动的eGFP在CGE衍生的interneurons的表达，我们使用了DLX5 / 6增强子元件和受限制了注射至E15.5，在产生阶段的大部分CGE衍生的interneurons。我们所进行的分析，在P8和P15 ^11（ 图1和2）。我们通过共电穿孔àCAG-mCherry和DLX5 / 6-EGFP质粒等摩尔浓度在E15.5电穿孔证实神经元的腹起源。在这个实验中，我们观察到位于脑室下区（SVZ）的合作只是腹部祖细胞表达两种蛋白^11。荧光蛋白的这个时空时空表达与DLX5和6基因的正常发育阶段的表达，其不表达于心室但subventr一致icular区^4。此外，我们评估DLX5 / 6 mCherry电穿孔的interneurons的GABA能认同的GAD67-EGFP敲入小鼠品系。我们发现，电穿孔的.......

Discussion

该技术的局限性

尽管该技术允许对细胞过程的细胞中自主分析，它是不适合于人口分析。在电穿孔是非常稀疏的不到一千细胞每大脑电穿孔。因此，该技术不能被用来评估从CGE衍生的interneurons的遗传操作而产生的行为后果。

而电穿孔进行在E13.5-E14.5目标MGE衍生的亚型，效率低^10。我们推测，DLX5 / 6增强剂是在有丝分裂后的MGE亚型活性较低，至少在附加型表达的情况下。

相对于现有方法的意义

该技术代表从先前电穿孔方法^[12,13]为的interneurons的研究进展。由于其相对稀缺性和胚胎的腹面NIC的起源，神经元的这部分人口已经证明，很难瞄准。我们的技术提供了手段，开展专家咨询小组，衍生的interneurons细胞自主性分析。高含量的eGFP表达允许单个的interneurons的可视化和分析。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
电穿孔仪  带踏板	Protech International	CUY21
5 mm 桨状电极	Protech International	CUY650P5
加热垫	Kent Scientific	DCT-15
Sutter Instruments P30拉拔器	Sutter Instruments	3282322
Fluovac 麻醉系统	哈佛仪器726425
精细手术剪刀 4.75" 直锐/锐利	Roboz	RS-6702
5-0 丝黑色编织 18" C-1 盒子 36	Roboz	SUT-1073-21
微型夹应用镊子 5.5"	Roboz	RS-5410
2 夹式剪刀	Roboz	RC-4894
握住镊子	精细科学工具	11031-15
玻璃毛细管	FHC	27-30-0	硼硅 1.0 毫米外径 x 0.75 毫米内径
绿色	Sigma-Aldrich	F7258
无菌 PBS	Life Technologies	20012-027