Abstract
中枢神経系（CNS）成熟の研究は、ニューロン集団の遺伝的標的化に依存しています。しかし、特定のニューロンのサブタイプに関心のある遺伝子の発現を制限するタスクが原因特定のプロモーターエレメントの相対的希少性に著しく困難なことが証明されている。 GABA作動性ニューロンは、大規模な遺伝的および形態的多様性ニューロン集団を構成している。確かに、GABA作動性介在ニューロンの11を超える異なるサブタイプは、マウスの大脳皮質1に特徴付けられている。ここでは、GABA作動性集団の選択的標的化のために適合したプロトコルを提示する。私たちは、ホメオボックス転写のエンハンサーエレメントを使用することによりGABA作動性ニューロンのサブタイプ選択的ターゲティングを達成し子宮内電気穿孔法で特定の遺伝子の発現を介して駆動するためにDLX5とDlx6、ショウジョウバエ遠位レス（DLL）遺伝子2,3のホモログを、要因。
Introduction
皮質GABA作動性介在ニューロンの大部分は、内側と尾側神経節隆起（MGEそれぞれとCGE）をという名前の2つの一過性の胚の構造から発生4。パルブアルブミンおよびソマトスタチンを発現するニューロンは、ニューロンは、CGEから発信表現カルレチニン（CR）、Vasointestinalペプチド（VIP）およびリーリン（再）に対し、MGEに由来する。これらのニューロンのサブタイプは、その誕生日によって区別することができる。 MGE派生サブタイプは胎生9.5（E9.5）とE16.5 5,6の間に生まれている。これとは対照的に、CGE派生介在ニューロンは、それらの生産がE15.5 6でピークに達してE12.5からE18.5を通して生まれている。この後半生まれの人口の遺伝的標的化は、しかし、とらえどころのないままになります。
ネズミ遠位レス（デラックス）の遺伝子はもっぱら発展途上腹側前脳3で表現される。 GABA作動性介在ニューロンと線条体投射ニューロンではなく、皮質錐体細胞がDlx1を表現、初期の発達段階3での2,5、及び6つの遺伝子。実際、 デラックス遺伝子は、すべてのGABA作動性前駆細胞におけるMGEとCGE脳室下帯（SVZ）で表現される。これらの遺伝子の発現は、有糸分裂後の段階7-9でのサブタイプを選択するために制限となる。以前の実験的証拠は、DLX5 / 6エンハンサーエレメントは、トランスジェニックマウスモデル2におけるGABA作動性系統の選択的ターゲティングを可能にすることを示した。私たちは、発生中のマウス脳におけるエピソーム発現の文脈におけるこれらのエンハンサーエレメントの1つの使用を試験した。私たちは、サブブルースクリプト（BS）骨格プラスミド（ 図1）における最小プロモーターおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）と共にDLX5 / 6エンハンサーエレメントをクローニングした。私たちは、選択的にCrイオン、VIPおよび再サブタイプ3,8,10を標的とするためにE15.5での子宮内電気穿孔中によりプラスミドを導入しました。私たちの技術は容易にスパースエレクトロポレーションを可能にする焦がす細胞の形態学的特徴の再構築。また、皮質GABA作動性ニューロンにおける遺伝子発現の非常に高いレベルの機能研究を可能にします。私たちは、いくつかの野生型およびドミナントネガティブ遺伝子11を用いた機能研究の損失と利得を実施しました。
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Protocol
全ての動物は、医学のNYUの学校の施設内動物管理使用委員会の規則やガイドラインに沿って処理した。
マウス系統
TACONICによって提供スイスウェブスター雌マウスをこれらの実験に使用した。具体的に表層のニューロンを標的化するために、E15.5胚を使用した。
注：この作品で使用されたプラスミド（DLX5 / 6.eGFPプラスミド3μgを/μl）を、標準的なクローニング技術を使用して生成された。 eGFPの cDNAはDLX5 / 6-Pminは、ポリAプラスミドにクローニングした。このプラスミドは、要求（demarn02@nyumc.org）に応じて入手可能です。
マイクロインジェクションピペットの作製
- 860に引っ張りヒート＃2を設定してください。
- フィラメントに近いガラスキャピラリーを配置し、固定します。ピペットの外径（OD）が約30ミクロンであることを確認してください。
- 「プル」ボタンを押します。
- 慎重にキャピラリーを削除します。底部が針である。上部を捨てる。
2麻酔手順
- イソフルラン収納室を準備します。注：イソフルランは、その高速動作や副作用の発生率が低い、好ましい麻酔薬である。ペントバルビタールは、別のオプションです。しかしながら、この薬物の耐性は可変であり、イソフルランよりも高い死亡率につながる可能性がある。
- 0.5-1リットル/分のO 2中4から5パーセントにイソフルランの流れを設定します。
- ヘッドアダプタ用のバルブが閉じているのに対し、室内用のバルブが開いていることを確認してください。
- チャンバー内に妊娠したマウスを置きます。
- マウスは麻酔の影響下で行くことを許可します。これは、約2〜3分かかります。呼吸数をチェックしてください。マウスが過呼吸始めた場合、イソフルランの投与量を下げる。
- マウスを麻酔した後は、速やかにチャンバーから取り外します。加熱パッド上で腹側を上に置き、私手術全体にイソフルランを供給していきますマスクで頭をnsert。ヘッドアダプタピースを接続するチューブにチャンバーからイソフルランの流れを切り替えるようにしてください。各眼内の眼潤滑剤のドロップを入れて、目を閉じて。
- 低体温症を最小限にするために36℃度に加熱パッドを設定してください。
- 後足と尾をつまんで足と尾反射の不在を確認してください。
3。手術
- 70％エタノールで腹部を覆っている皮膚を清潔に。
- 上向きに皮膚を引っ張って鉗子を使用してください。各手術後、洗剤と水ですべての楽器を洗浄し、72℃のCO / Nで滅菌した。
- 乳腺の3番目と4番目のペアの間の中間に始まる正中線に沿って小さな垂直切開（約2cm）を作成します。細かい手術はさみを使用してください。腹壁を損傷しないように注意してください。
- 静かに腹膜から皮膚を分離する。
- 動脈を可視化腹壁上の静脈。腹腔を露出させ（血管を避ける）腹膜を介して他の2センチメートル垂直の切開を加えます。
- 動脈をクランプ避け各側の皮膚や腹壁をクランプ。動脈を誤ってパンクしている場合は、頸椎脱臼またはイソフルラン過剰投与を行うことで、すぐに動物を犠牲に：注意してください。
- 前37℃に滅菌PBSを温める。キムワイプ湿ったPBSでクランプをカバー。
- PBSで露光され、腹腔に潤いを与える。手術を行いながら、この手順を数回繰り返します。
- ラウンド鉗子を使用して、静かにキャビティからの胚チェーン（E15.5）を引く。ウェットティッシュ上の鎖の残りをしましょう。最初の子宮の半分を露出することから始めます。その中の胚をエレクトロポレーションされた後、後半では動作した後、内部に戻ってそれを持って来る。
4。エレクトロポレーション
- 胚を操作するために丸いピンセットを使用し続ける。
- 6側脳室をsualize。正中線（ 図1b）に沿って走る側脳室。
- 注射の間、それを可視化する1：20混合物のためのDNA溶液に：ファストグリーン（10％w / vの株式）を追加します。蒸留水で標準マキシプレップ精製プロトコルから得られたペレットを溶解させてDNA溶液を調製します。
- ファストグリーンでDNA溶液1ミリリットル（DLX5 / 6-EGFP、3μgの/μl）を注入するためにプランジャーで前に引っ張らマイクロピペットを使用してください。ピペットをロードする前に、針の先端の最後に肩の先頭から6ミリメートルの長さを残すように細かい鉗子＃5（デュモン）でマイクロピペットの先端をカットします。丸いピンセットで胚の頭部を持ってください。正中線の近くに位置し、側脳室を目指して45°の角度でピペットを用いて、脳を入力してください。針が心室を貫通する場合には、DNAを注入するプランジャーを使用したように、ゆっくりとピペットを撤回。心室はグリーンに点灯したとき解決策は、それを埋めるために開始されます。この時点で、ピペットを移動を停止し、DNAの1ミリリットルを注入。静かに、ピペットを撤回。
- 950ミリ秒だけ離れた50ミリ秒の5 45VパルスにCUY21のエレクトロを設定します。
- E15.5胚のために5mmのパドル電極を使用してください。効率的な電流伝達を確実にするために、PBS中の電極を浸し。
- DNA溶液を含む心室にプラスのパドルを胚の頭の周りの電極パドルを配置します。少し神経節隆起を通して腹側に電流を作成するために、負の1のに対して正のパドルを下げる。この操作は錐体細胞における異所性発現を最小限に抑えることができます。
- 電極を配置した後、一度フットペダルを押して、パルスを供給。
- 電極を取り外し、きれいなそれらを拭いてください。繰り返します各胚を4.6から4.9を繰り返します。
- すべての胚をエレクトロ後、腹腔内に3mlのPBSを注ぎ、腹腔に戻す。
- 第1の縫合湾曲した針と5-0絹縫合した後、皮膚と腹壁。傷口にリドカイン（4％）を適用します。鎮痛のためのアスピリンのイントラ腹膜120mgの/ kgのを管理します。
注：全体の手順は、20分以内に行われるべきである。それは、初心者は、短い動作時間を維持するために、いくつかの胚をエレクトロポことをお勧めします。長時間の手術は胚の生存率を減少させる。 - 麻酔管から動物を取り出し、拭い紙に加熱パッド上で回復を可能にします。
- 、ケージに動物を返し、37℃で加熱パッド上にそれを維持し、健康状態を監視します。動物は一般的によく手術に耐え、それらが麻酔管から除去された後すぐにゆっくりと移動し始める。過度の出血や無気力が認められた場合、動物実験委員会は、頸椎脱臼または麻酔の過剰摂取などの安楽死の手続きを承認し実行することで、すぐに動物を生け贄に捧げる。
- ビバにケージを返すバクテ。女性は自然に出産します。
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Representative Results
私たちは、成熟ニューロンの細胞型特異的ターゲティングを達成するために、 子宮内エレクトロポレーション技術を適合される。 CGE由来のニューロンにおけるEGFPの発現を駆動するためには、CGE由来のニューロンの大部分が生成される段階、DLX5 / 6エンハンサーエレメントを使用し、E15.5に私達の注射を制限した。私たちは、P8とP15 11（ 図1および図2）で解析を行った。私たちは、E15.5での等モル濃度で、CAG-mCherryをとDLX5 / 6-EGFPプラスミドをエレクトロポレーションの共同による電気穿孔ニューロンの腹側の原点を確認した。この実験では、脳室下帯（SVZ）の共同に位置だけ腹前駆細胞は、両方のタンパク質11を発現したことを観察した。蛍光タンパク質のこの時空間時間的発現は、正常な発達心室で表現されていないDLX5及び6の遺伝子の発現が、subventrと一致しているicularゾーン4。さらに、私たちはGAD67-EGFPノックインマウス系統にDLX5 / 6-mCherryをエレクトロポレーション介在ニューロンのGABA作動性同一性を評価した。私たちは、エレクトロポレーション、ニューロンの大半はGAD67、すべてのGABA作動性細胞11によって発現された酵素を発現していることがわかった。また、私たちはP15で免疫組織化学および電気生理学的分析を行うことによってエレクトロポレーション介在ニューロンのサブタイプの同一性を決定した。サブタイプ特異的マーカーの発現のパターンは、クリオスタット切片における免疫蛍光11（ 図2）によって明らかにした。私たちは、以前にCGE由来の介在ニューロンのマーカーが6で説明、E15.5でエレクトロ介在ニューロンがほぼ独占的にNPYを発現することを発見、リーリン、VIPおよびCr。さらに、これらのニューロンの固有電気生理学的特性は、以前に運命マッピング研究6,11に記載のものと一致している。すべて一緒に、これらの結果は、そのelectropoを示しているE15.5でのDLX5 / 6エンハンサー要素との比が選択的にCGE由来の介在ニューロンサブタイプをターゲットにしています。
エレクトロポレーション実験の1模式図。 a）は DLX5 / 6-EGFPプラスミドのための戦略をサブクローニング。b）の図は、実験的な戦略を示した。
図2エレクトロポ介在ニューロンはCGE由来のサブタイプのマーカーの発現によって線引きされる。 DLX5 / 6-EGFPプラスミドでエレクトロA）CGE由来介在ニューロン。多様なCGEサブタイプのまばらなエレクトロポレーションに注意してください。B）P8でのVIP発現介在ニューロン。 eGFP発現を描写全体樹状ツリーと、単一のニューロンの軸索アーバ。C）P8でのNPY発現介在ニューロン。 NPY式はneurogliaform細胞。D）P15でのNPY発現介在ニューロンの輪郭を描く。スケールバーA、100ミリメートル; BDが50mm
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Discussion
技術の限界
この技術は、細胞プロセスの細胞自律的な分析を可能にするが、それは集団分析には適していない。エレクトロポレーションは、脳あたりにエレクトロ未満千細胞と非常に疎である。結果として、この技術は、CGE由来のニューロンの遺伝子操作から生じる行動の結果を評価するために使用することができない。
エレクトロポレーションは、E13.5-E14.5ターゲットMGE由来のサブタイプで行っているが、効率が10低い。私たちは、DLX5 / 6エンハンサーは少なくともエピソームの発現との関連で有糸分裂後MGEサブタイプにおける活性が低いと推測している。
既存の方法に関して意義
技術は介在ニューロンの研究のため、以前にエレクトロポレーション法12,13から進歩を表しています。それらの相対的な希少性と腹側胚のためにNIC原点は、神経細胞のこの集団は、対象とすることは困難であることが判明している。私たちの技術は、CGE由来介在ニューロンの細胞自律的な分析を行うための手段を提供する。 eGFP発現の高いレベルは、単一のニューロンの可視化および解析を可能にする。
将来の応用
特定のプラスミドおよび遺伝的に改変されたマウス系統の使用を組み合わせることにより、目的の遺伝子の発現の時間的および空間的制御を達成することが可能である。例えば、私たちはのtetO誘導性導入遺伝子の発現をオンにするDLX5 / 6ったプラスミドを使用していました。これらの実験では、ドキシサイクリン8を投与することにより、導入遺伝子発現をサイレンシングすることができました。現在、クレエシステムと組み合わせて技術を使用するプロトコルを開発している。
議定書の中の重要なステップ
効率的なエレクトロポレーションおよび生存を達成するために、excesを回避しようと胚および/または器官の操作をSIVE。また、動脈と静脈を挟まないようにしてください。出血が発生した場合、マウスはすぐに血液量減少になります。エレクトロポレーションが完了したら、あなたは彼らが低酸素症を引き起こす可能性がよじれを作成しないように見られるのと同じ位置に胚や器官を配置します。 20分以下の手術時間を目指す。手術中にPBSを何度もして腹腔に潤いを与える。エレクトロポレーション時には、キャピラリ針で一度だけ心室を穿刺してみてください。繰り返しクチャリングは、生存率が低下します。トレーニング期間の後、生存率は80％以上であるべきである。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
私たちは、技術支援のためのLihong陰に感謝しています。 NVDはNARSAD若手研究賞を受賞であり、また、NIH（5 K99 MH095825-02）からの助成金によってサポートされています。 Fishellラボでの研究は、国立衛生研究所、国立精神衛生研究所（5 R01 MH095147-02、5 R01 MH071679-09）、神経疾患·脳卒中研究所（5 R01 NS081297-02、1 P01 NS074972によってサポートされている-01A1）とシモンズ財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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