Abstract
המחקר של התבגרות מערכת עצבים מרכזית (CNS) מסתמך על מיקוד גנטי של אוכלוסיות נוירונים. עם זאת, המשימה של הגבלת הביטוי של גנים המעניינים את תת עצביים ספציפיים הוכיחה להפליא מאתגרת בשל המחסור היחסי של אלמנטי אמרגן ספציפיים. interneurons GABAergic מהווה אוכלוסייה עצבית עם מגוון גנטי ומורפולוגיים נרחבים. ואכן, יותר מ -11 תת שונה של interneurons GABAergic מתאפיינים בקליפת העכבר 1. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם למיקוד סלקטיבי של אוכלוסיות GABAergic. השגנו מיקוד סלקטיבי תת סוג של interneurons GABAergic על ידי שימוש באלמנט משפר של שעתוק homeobox גורמי Dlx5 וDlx6, homologues של גן דיסטלי פחות דרוזופילה (DLL) 2,3, לנהוג הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות electroporation ברחם.
Introduction
את חלק הארי של interneurons GABAergic קליפת המוח מקורן שני מבנים עובריים חולפים בשם הוד ganglionic המדיאלי וזנב (MGE וCGE בהתאמה) 4. Parvalbumin וinterneurons סומטוסטטין להביע מקורן בMGE ואילו Calretinin (Cr), Vasointestinal פפטיד (VIP) וReelin (Re) להביע interneurons מקורן CGE. ניתן להבחין תת interneuron אלה על ידי תאריכי הלידה שלהם. תת נגזר MGE נולדים בין יום העוברי 9.5 (E9.5) וE16.5 5,6. בניגוד לכך, interneurons CGE נגזר נולד מE12.5 דרך E18.5 עם הייצור שלהם הגיע לשיא של E15.5 6. המיקוד הגנטי של אוכלוסייה בסוף נולד זה, עם זאת, נותר חמקמק.
גנים העכבריים דיסטלי פחות (DLX) באים לידי ביטוי אך ורק במוח הקדמי הגחון פיתוח 3. interneurons GABAergic ונוירונים הקרנת striatal אבל תאים פירמידליים לא בקליפת המוח לבטא Dlx1, 2,5, ו -6 גנים בשלבי התפתחותיים מוקדמים 3. ואכן, גני DLX באים לידי ביטוי באזור subventricular MGE וCGE (SVZ) בכל אבות GABAergic. ביטוי של גנים אלה הופך מוגבל כדי לבחור תת בשלבי postmitotic 7-9. ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי האלמנט משפר Dlx5 / 6 מאפשר למיקוד סלקטיבי של שושלות GABAergic במודלים של עכברים מהונדסים 2. אנחנו בדקנו את השימוש באחד מהאלמנטים משפר אלה בהקשר של ביטוי episomal במוח העכבר המתפתח. אנו תת משובטים האלמנט משפר Dlx5 / 6 יחד עם אמרגן מינימאלי והחלבון המשופר הירוק הניאון (eGFP) בפלסמיד עמוד השדרה bluescript (BS) (איור 1). אנחנו הצגנו את הפלסמיד באמצעות ברחם electroporation בE15.5 למקד Cr-, VIP באופן סלקטיבי והוא זכר תת 3,8,10. הטכניקה שלנו מאפשרת לelectroporation הדליל, המאפשרהבנייה מחדש של תכונות מורפולוגיות של תאים לחרוך. בנוסף, הרמות גבוהות במיוחד של ביטוי גנים בתאי עצב בקליפת המוח GABAergic מאפשרת ללימודים פונקציונליים. בצענו הפסד ורווח של מחקרים לתפקד באמצעות מספר סוג בר והגנים שליליים דומיננטיים 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טופלו כל בעלי החיים בהתאם לתקנות וההנחיות של ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של בית הספר באוניברסיטת ניו יורק לרפואה.
זני עכבר
נקבות עכברים שוויצריים וובסטר הניתנים על ידי Taconic שמשו לניסויים אלה. על מנת למקד ספציפית interneurons שכבה שטחי, עוברי E15.5 היו בשימוש.
הערה: פלסמיד המשמש בעבודה זו (Dlx5 / 3 מיקרוגרם / μl פלסמיד 6.eGFP) נוצרה תוך שימוש בטכניקות שיבוט סטנדרטיים. EGFP cDNA שובט לתוך פלסמיד / 6-Pmin-הפולה Dlx5. פלסמיד זו זמין על פי בקשה (demarn02@nyumc.org).
.1 הכנת Microinjection מטפטף
- הגדר את חום חולץ # 2-860.
- מקום ולאבטח את נימי הזכוכית ליד נימה. בדוק שהקוטר החיצוני (OD) של פיפטה הוא בערך 30 מיקרומטר.
- לחץ על לחצן "למשוך".
- מוציא בזהירות את הנימים. החלק התחתון הוא המחט. מחק את החלק העליון.
.2 הרדמה נוהל
- הכן תא isoflurane מכיל. הערה: Isoflurane היא ההרדמה המועדפת בשל הפעולה מהירה שלה ושכיחות נמוכה של תופעות לוואי. Pentobarbital אפשרות נוספת; עם זאת, סובלנות של תרופה זו היא משתנה ועלולה להוביל לשיעור תמותה גבוה יותר מisoflurane.
- הגדר את זרימת isoflurane ל4-5% ב0.5-1 L O / 2 דקות.
- ודא שסתום לתא פתוח ואילו שסתום למתאם הראש סגור.
- מניחים את העכבר בהריון בתא.
- אפשר העכבר כדי ללכת תחת השפעת ההרדמה. זה ייקח בערך 2-3 דק '. בדוק את קצב הנשימה. אם העכבר מתחיל נשימת יתר, להוריד את המינון של isoflurane.
- אחרי העכבר מורדם, מייד להסיר אותו מהחדר. מניחים בצד גחונו על כרית החימום ואניnsert הראש במסכה שתמשיך לספק isoflurane לאורך כל הניתוח. הקפד להחליף את זרימת isoflurane מהתא עד לצינורות המחברים את חתיכת מתאם הראש. שים טיפה של חומר סיכה עין בכל עין ולסגור את העיניים.
- הגדר את כרית החימום ל36 ° מעלות צלזיוס כדי למזער היפותרמיה.
- הגעה להיעדר רפלקסים רגל וזנב על ידי צובט את רגליו האחוריות וזנב.
.3 ניתוח
- לנקות את העור המכסה את הבטן עם אתנול 70%.
- שימוש במלקחיים כדי למשוך את העור כלפי מעלה. לאחר כל ניתוח, לשטוף את כל הכלים עם חומר ניקוי ומים, ומעוקר ב72 ° CO / N.
- לעשות חתך קטן אנכי (כ -2 ס"מ) לאורך קו האמצע מתחיל באמצע הדרך בין הזוגות שלישיים והרביעי של בלוטות החלב. השתמש במספרי ניתוח עדינים. יש להיזהר שלא לפגוע בקיר הבטן.
- בעדינות להפריד את העור מהצפק.
- דמיינו את העורקיםוורידים על קיר הבטן. לעשות עוד חתך אנכי 2 סנטימטר דרך הצפק (הימנעות כלי) כדי לחשוף את חלל הבטן.
- הצמד את העור ודופן בטן בכל צד הימנעות כיווץ העורקים. הערה: אם העורקים ניקבו בטעות, להקריב בעלי החיים באופן מיידי על ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם או ממנת יתר isoflurane.
- מראש לחמם את PBS סטרילי ל37 מעלות צלזיוס. כסה את ווי התלייה עם PBS הלח קים מגבונים.
- לחות בחלל הבטן החשופה עם PBS. חזור על פעולה זו מספר פעמים בעת ביצוע הניתוח.
- בעזרת מלקחיים עגולים, משוך בעדינות את השרשרת העוברית (E15.5) מהחלל. תן את שאר השרשרת במגבונים לחים. התחל על ידי חשיפת מחצית מהרחם ראשונה. ברגע שעובר בו הם electroporated, להביא אותו חזרה פנימה, ואז לעבוד על המחצית השנייה.
.4 Electroporation
- תמשיך להשתמש במלקחיים עגולים כדי לתפעל את העוברים.
- ויsualize חדרים לרוחב. החדרים לרוחב לרוץ לאורך קו האמצע (איור 1b).
- להוסיף ירוקים (צילומים: 10% w / v) מהיר לפתרון DNA לתערובת 01:20 לדמיין אותו במהלך ההזרקה. הכן את פתרון DNA על ידי המסת גלולה המתקבלת מפרוטוקול טיהור maxi-prep סטנדרטי במים מזוקקים.
- השתמש micropipettes מראש משך עם בוכנה להזרקה 1 מ"ל של תמיסת DNA (Dlx5 / 6-eGFP, 3 מיקרוגרם / μl) עם גרין המהיר. חותך את קצה micropipette עם מלקחיים # קנס 5 (דומון) לעזוב מ"מ אורך 6 מתחילת הכתף אל הקצה של הקצה של המחט לפני טעינת פיפטה. החזק את ראשו של העובר עם פינצטה העגולה. הזן את המוח עם פיפטה ב45 ° זווית מכוונת לרוחב החדר ממוקם בסמוך לקו האמצע. אם המחט חודרת דרך החדר, לחזור לאט פיפטה כפי שאתה משתמש הבוכנה להזריק DNA. החדר צריך להפוך ירוק כאשרפתרון מתחיל למלא אותו. בשלב זה, מפסיק לנוע פיפטה ולהזריק 1 מ"ל של DNA. בעדינות, למשוך את פיפטה.
- הגדר את electroporator CUY21 לחמישה 45V פולסים של 50 אלפיות שניים במרווחים על ידי 950 אלפיות שניים.
- השתמש אלקטרודות ההנעה 5 מ"מ לעוברי E15.5. טובלים את האלקטרודות בPBS כדי להבטיח העברת נוכחית יעילה.
- מניחים את משוטי אלקטרודה סביב ראשו של העובר עם ההנעה החיובית על החדר המכיל את פתרון DNA. מעט נמוך יותר ההנעה החיובית עם בגין שלילי אחד כדי ליצור נוכחי הגחון דרך הוד ganglionic. מניפולציה זה תהיה למזער ביטוי מחוץ לרחם בתאים פירמידליים.
- לאחר שהניח את האלקטרודות, לספק דופק על ידי לחיצה על דוושת רגל פעם אחת.
- הסר את אלקטרודות ולנגב אותם נקי. חזור על שלבים 4.6-4.9 עם כל עובר.
- , לאחר electroporating כל העוברים לשפוך 3 מ"ל של PBS לתוך חלל הבטן ולהחזיר אותם לחלל הבטן.
- התפר ראשון דופן הבטן עם מחט מעוקלת ו5-0 תפר משי ולאחר מכן העור. החל לידוקאין (4%) על הפצע. לנהל 120 מ"ג / קילוגרם של הצפק התוך האספירין לשיכוך כאבים.
הערה: כל ההליך צריכה להתבצע ב20 דקות או פחות. מומלץ כי מתחילים electroporate רק כמה עוברים כדי לשמור על זמן פעולה קצר. ניתוחים ממושכים יקטינו את שיעור ההישרדות של העוברים. - הסר את החיה מצינורות ההרדמה ולאפשר התאוששות בכרית החימום על נייר לנגב.
- חזור חיה לכלוב, לשמור אותו על כרית החימום על 37 מעלות צלזיוס ולנטר את מצב הבריאות. בעלי החיים בדרך כלל לסבול את הניתוח היטב ומתחילים לנוע באיטיות זמן קצר לאחר שהם הוסרו מצינורות ההרדמה. אם דימום או עייפות מוגזם הוא ציין, להקריב בעלי החיים באופן מיידי על ידי ביצוע IACUC אישר נהלי המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם או ממנת יתר הרדמה.
- חזור כלוב לvivarium. הנקבות ללדת באופן טבעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו התאמנו את טכניקת electroporation ברחם כדי להשיג מיקוד ספציפי סוג התא של תאי עצב התבגרות. לנהוג הביטוי של eGFP בinterneurons נגזר CGE, השתמשנו באלמנט משפר Dlx5 / 6 ומוגבלים הזריקות שלנו לE15.5, השלב שבו רוב interneurons נגזר CGE נוצרים. אנחנו ביצענו את הניתוח בP8 וP15 11 (איורים 1 ו -2). אנחנו אישרו את המוצא הגחון של נוירונים electroporated על ידי שיתוף electroporating CAG-mCherry וDlx5 פלסמידים / 6-eGFP בריכוזים equimolar בE15.5. בניסוי זה, שמו לב שאבות הגחון היחידים הממוקמים בשיתוף אזור subventricular (SVZ) הביעו שני החלבונים 11. ביטוי זמני במרחב זה של חלבוני ניאון עולה בקנה אחד עם הביטוי הנורמלי ההתפתחותי של Dlx5 ו6 גנים, שאינם באים לידי ביטוי בחדרית אבל subventrאזור icular 4. יתר על כן, אנו הערכנו את זהות GABAergic של interneurons Dlx5 / 6-mCherry electroporated בקו העכבר להתרפק GAD67-eGFP. מצאנו כי רובם המכריע של נוירונים electroporated הביע GAD67, אנזים בא לידי ביטוי בכל תאי GABAergic 11. בנוסף, אנו קובעים את הזהות תת הסוג של interneurons electroporated על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה וניתוח אלקטרו בP15. דפוס ביטוי של סמנים ספציפיים תת סוג התגלה על ידי immunofluorescence בסעיפי cryostat 11 (איור 2). מצאנו כי interneurons electroporated ב E15.5 כמעט אך ורק להביע את NPY, Reelin, VIP וCr, שתואר קודם לכן סמני interneuron נגזרים CGE 6. יתר על כן, מאפייני אלקטרו הפנימיים של הנוירונים האלה הם בהסכם עם אחד שתואר קודם לכן במחקרי מיפוי גורל 6,11. כולם יחד, תוצאות אלו מצביעות על electropo שמנה עם האלמנט משפר Dlx5 / 6 בE15.5 סלקטיבי למקד תת interneuron נגזר CGE.
איור 1 ייצוג סכמטי של ניסויי electroporation. ) subcloning אסטרטגיה לDlx5 / 6-eGFP פלסמיד. ב) תרשים הממחיש את האסטרטגיה הניסיונית.
interneurons איור 2 Electroporated מסומן בביטוי של סמנים תת סוג נגזר CGE. ) Interneurons המופק CGE electroporated עם פלסמיד / 6-eGFP Dlx5. הערה electroporation הדליל של תת CGE המגוון. B) interneuron להביע VIP בP8. ביטוי eGFP משרטטעץ כולו dentritic וסוכת axonal של נוירונים בודדים. C) interneuron להביע NPY בP8. ביטוי NPY מתווה תאי neurogliaform. D) interneuron להביע NPY בP15. סרגל קנה מידה, 100 מ"מ; BD, 50 מ"מ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מגבלות של הטכניקה
בעוד טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוטונומי תא של תהליכים בתא, זה לא מתאים לניתוח אוכלוסייה. Electroporations מאוד דליל עם פחות מאלף תאים electroporated לכל מוח. כתוצאה מכך, הטכניקה לא ניתן להשתמש כדי להעריך את השלכות התנהגות הנובעות מהמניפולציה הגנטית של interneurons נגזר CGE.
בעוד electroporations בוצע בתת נגזר MGE יעד E13.5-E14.5, היעילות היא 10 נמוכים. אנו משערים כי Dlx5 / 6 משפר הוא פחות פעיל בתת MGE postmitotic לפחות בהקשר של ביטוי episomal.
משמעות ביחס לשיטות קיימות
הטכניקה מייצגת קידום מהעבר שיטות electroporation 12,13 לחקר interneurons. בשל המחסור היחסי שלהם ועובר הגחוןמקור nic, אוכלוסייה זו של תאי עצב הוכיחה קשה למקד. הטכניקה שלנו מספקת את האמצעים לביצוע ניתוח תאים אוטונומיים של interneurons נגזר CGE. הרמות גבוהות של ביטוי eGFP מאפשרות ההדמיה וניתוח של interneurons היחיד.
יישומים עתידיים
על ידי שילוב של השימוש בפלסמידים ספציפיים וקווי עכבר מהונדסים גנטי שניתן להשיג שליטה של זמן ומרחב בביטוי של גנים של עניין. לדוגמא, השתמשנו בפלסמיד / 6-TTA Dlx5 כדי להפעיל את הביטוי של גנים מושתלים של מושרה TETO. בניסויים אלו, היינו יכולים להשתיק את ביטוי transgene על ידי בניהול דוקסיציקלין 8. אנחנו מפתחים כיום פרוטוקול להשתמש בטכניקה בשילוב עם מערכת קואל.
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
כדי להשיג electroporation והישרדות יעיל, מנסה להימנע excessive מניפולציה של העוברים ו / או איברים. בנוסף, להימנע מצביטת עורקים וורידים. העכבר יהפוך במהירות hypovolemic אם דימום מתרחש. לאחר electroporation יושלם, למקם את העוברים ואיברים באותן עמדות שבו אתה נמצא אותם כדי להימנע מסטיות יצירת שיכול לגרום לחוסר חמצן. לשאוף 20 דקות או פחות זמן ניתוח. לחות בחלל הבטן עם מספר רב של פעמים PBS במהלך הניתוח. במהלך electroporation, מנסה לנקב את החדר רק פעם אחת עם מחט הנימים. ניקוב חוזר ונשנה יקטין את שיעור ההישרדות. לאחר תקופת ההכשרה, שיעור ההישרדות צריך להיות 80% או גבוהים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לLihong יין לקבלת סיוע טכני. NVD הוא נמען פרס חוקר צעיר NARSAD של ונתמך גם על ידי מענקים מNIH (5 K99 MH095825-02). מחקר במעבדה Fishell נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הנפש (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), מכון לאומי להפרעות ושבץ (5 R01 NS081297-02 נוירולוגיות, 1 P01 NS074972 -01A1) וסימונס הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
