Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Summary

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Abstract

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long preparaat wordt veel gebruikt visualiseren en definiëren signalering in enige microvaatjes. Door de koppeling van deze voorbereiding met real-time beeldvorming, wordt het mogelijk om de permeabiliteit in de individuele pulmonale bloedvaten te bepalen. Hierin beschrijven we stappen rattenlongen isoleren en perfuseren ze met autoloog bloed. Vervolgens schetsen we stappen om fluoroforen of agenten via een microkatheter bezielen in een kleine long regio. Met behulp van deze procedures beschreven, bepaalden wij permeabiliteit toename rattenlong microvaatjes in reactie op infusies van bacteriële lipopolysaccharide. De gegevens bleek dat lipopolysacharide toegenomen lek in zowel venular en capillaire microvessel segmenten. Dus deze methode is het mogelijk om de permeabiliteit antwoorden vergelijken tussen vasculaire segmenten en daarmee vast elke heterogeniteit in de respons. Terwijl gebruikelijke methoden longpermeabiliteit definiëren nabewerking vereisen longweefsel monsters, degebruik van real-time beeldvorming ondervangt deze eis zoals blijkt uit de huidige werkwijze. Zo is de gïsoleerde voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden om long microvasculaire permeabiliteit te bepalen, maar is een eenvoudige methode te ontwikkelen en te implementeren.

Introduction

Verhoogde microvasculaire permeabiliteit in de longen leidt tot ontwikkeling van alveolair oedeem evenals gemanipuleerde gasuitwisseling en is een belangrijk kenmerk van acute longbeschadiging (ALI) ^1-3. De ramingen van vasculaire permeabiliteit zijn belangrijk bij het bepalen van de omvang van longbeschadiging en effectiviteit van voorgestelde therapeutische interventies. Gravimetrische analyse zoals bloed vrij long nat-naar-droog-verhouding en microvasculaire filtratie coëfficiënt worden veel gebruikte methoden voor het schatten permeabiliteit ^4,5. Andere werkwijzen omvatten het kwantificeren het behoud van radioactieve of fluorescente probes in longweefsel ^6-8. De bovenstaande methoden vereisen postexperiment verwerking longweefsel monsters naar het ophelderen van de permeabiliteit gegevens. Aangezien een dier alleen kan worden gebruikt voor een behandelingsprotocol, kunnen grote aantallen dieren vereist voor volledige studie. Een gemeenschappelijk kenmerk van de bovengenoemde werkwijzen is dat zij bepalen de gemiddelde vasculaire permeabiliteit vooralle bloedvaten in het weefselmonster. Het is echter bekend dat long micro-en macro-vaartuigen fenotypisch verschillend ^9. Daarom kan permeabiliteit responsen heterogeen tussen de verschillende vlootsegmenten ook ^9,10. Zo kwantificeren gemiddelde permeabiliteit van alle longvaten in een weefselmonster kan onvoldoende rekening met deze heterogeniteit.

In de geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding, kan de bloedvaten op de long oppervlak worden gevisualiseerd door een rechtopstaande microscoop ^4,11,12. Hierdoor kunnen karakteriseren reacties in enkele schepen en dus de afhandeling van heterogeniteit in de antwoorden ^13. Bovendien, door gebruik van fluorescentie beeldvorming van microvaatjes, fluorescentie gebaseerde testen kunnen worden opgenomen. Verder kan een linker atrium microkatheter worden om middelen en fluorescentie probes leveren in bloedvaten ^11,14. De microcatheter beperkt de levering aan een kleine long regio, aldus exposeren alleen de bloedvaten in de regio om de toegediende agenten en fluoroforen. Hierdoor kunnen meerdere kleine gebieden binnen dezelfde longen te worden gebruikt voor afzonderlijke experimenten, wat leidde tot een vermindering dieren nodig voor een studie.

Real time beeldvorming maakt vangst van dynamische veranderingen in vasculaire en extravasculaire fluorescentie van enkele microvessels van de gïsoleerde voorbereiding. Zo moet in elk microvaatje in een afbeeldingsveld, veranderingen in fluorescentie gedurende infusie van fluoroforen en washoff kan worden geregistreerd en gekwantificeerd offline ^14. Met behulp van de waarden van de maximale en de resterende vasculaire fluorescentie, kan een permeabiliteit index voor elke microvaatje binnen het beeldveld worden bepaald. Om doorlaatbaarheid verandert in reactie op ontstekingen of schadelijke stoffen te bepalen, kan de gewenste middel eerst worden toegediend en dan bepaald de permeabiliteit index. Bovendien kan het beeldveld overal ingesteld worden longzone toegediend als demicrokatheter, waardoor een hoge mate van flexibiliteit in de gewenste vasculaire netwerk. Zo is de geïsoleerde bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een aantrekkelijk experimenteel model om de permeabiliteit te kwantificeren in enkele long haarvaten.

Protocol

Alle experimenten uitgevoerd op dieren waren zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Tennessee Health Science Center.

1. Tubing voor perfunderen Rat Lung Voorbereidingen

1. Bereid een buissysteem met Tygon-buis (# 18) voor bloed perfusie zoals getoond in figuur 1. Sluit drukopnemers (P23XL) en plaats de slang op de microscoop podium.
2. Stel waterbadtemperatuur tot 37 ° C.
3. Sluit de long en uitlaat tijdelijk met Tygon slang.

Figuur 1. Blood perfusieslang. Het schema toont de slang setup gebruikt voor het circuleren van bloed door de gïsoleerde voorbereiding. Ook geschikt zijn bijbehorende componenten waardoor de buis is gerouteerd. Een schema van het hart en de longen wordt opgenomen om gebieden van verbinding tussen de buis en pulmonale arterie (PA) vertonen en het linker atrium (LA) canule (blauwe stippellijnen).

2. Voorbereiding van Geïsoleerde Rat Longen

1. Verdoven ratten (mannelijke Sprague-Dawley ratten, 250-300 g) met ketamine (80-100 mg / kg) en xylazine (5-10 mg / kg). Na het veiligstellen van een chirurgische vlak van anesthesie, plaats het dier in rugligging.
2. Voer tracheostomie, plaatst u een tracheacanule (PE-90) en bevestig met chirurgische hechtdraad.
3. Bezielen heparine (100-200 U) in het hart van hartpunctie (21 G vlinder naald), wacht 60 seconden en exsanguinate bloed (~ 12-15 ml bloed).
4. Bereid twee canules (Tygon slang, 3 mm diameter, 4 cm lang, uitlopend aan de ene kant) en vul met een zoutoplossing.
5. Voer een thoracotomie. Maak een insnijding (3 mm) op de rechter ventrikel en schuif het uitlopende einde van een canule in de incisie naar de pulmonaireslagader. Secure canule longslagader met chirurgische hechtingen.
6. Incise (3 mm) de apex van de linker ventrikel en schuif het uitlopende einde van de tweede canule in de incisie. Leid de canule in het linker atrium. Bevestig canule naar de linker hartkamer met een navelstreng tape (2 mm breed).
7. Ontleden elke bindweefsel, en verwijder de longen en het hart samen met de bijgevoegde canules. Plaats long en hart op een petrischaal. Verplaats de longen, zodat het middenrif oppervlak is op de top. De drie canules moeten dezelfde richting gezicht.
8. Plaats de long voorbereiding op een podium dat kan worden gemanipuleerd in het XY richtingen. Elke fase die wordt geleverd met een microscoop kan worden aangepast aan de slang of een op maat gemaakte fasen gebouwd, indien nodig houden.

3. Doorbloeding van Geïsoleerde Rat Longen

1. Meng het verbloeden bloed met een gelijk volume albumine (5%) oplossing en voeg het reservoir. Start de peristaltische pomp aan en zet stroom rat 14 ml / min. Laat bloed om de slang te vullen.
2. Met de shunt open is, verwijdert u de tijdelijke long inlaat-uitlaat connector. Bevestig de longslagader en linker atrium canule aan de longen en uitlaat, respectievelijk. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slang.
3. Sluit de tracheacanule aan een derde druk transducer (P23XL). Blaas longen met 30% zuurstof via de tracheacanule en de druk te handhaven op 5 cm H ₂ O.
4. Sluit de shunt met een klem aan longperfusie beginnen. Handhaaf longslagader en linker atrium druk op ~ respectievelijk 10 en 3 cm _H2O.

4. Voorbereiding Lung voor microvasculaire Infusion

1. Breng het achterste uiteinde van het verlengstuk van de katheter boven het niveau van de longen en veilig.
2. Bereid een infuuskatheter door het invoegen van ongeveer 30 cm van een 40 cm lange PE10 slang in een ~ 30 cm lang PE90 buis. Sluit het blootgestelde uiteinde van de PE10 slang aan een naald (30 G) opbevestigd aan een spuit (1 cc).
3. Plaats de katheter combinatie in het verhoogde achterste uiteinde van de verlenging buis. Leid de katheter combinatie op het linker atrium en in de longen totdat u weerstand voelt. Duw dan de PE10 katheter alleen verder in de longen totdat u weerstand voelt. Merk op dat het toepassen van buitensporig geweld tijdens het inbrengen van de katheter zal de long verwonden.
4. Vul het 1 cc spuit met Ringer-oplossing en hechten aan een injectiepomp. Stel infusiesnelheid tot 10 pl / min.
5. Infusie site zal bleke geworden in vergelijking met de rest van de long.
6. Bevochtig de long met zoutoplossing en bedekken de long met folie met een gat groot genoeg is om de infusieplaats onbedekt laten.
7. Wattenstaafje enkele kraan vet op de bodem van een O-ring (maat) en plaats een glazen dekglaasje (# 1.5, 22 mm diameter) op de bodem van de O-ring. Positie voorzichtig de O-ring met het dekglaasje op de infusieplaats. Zet de O-ring met een standaard test-tube holder. Het dekglaasje / O-ring combinatie bestaat niet de alveolaire structuren vervormen eronder, zoals onlangs gemeld ^15.
8. Plaats een objectief (20X) van een fluorescentiemicroscoop boven de O-ring gericht op het longoppervlak.

5. Imaging TL Dextraan doorvoer door microvessels

1. Bereid de microscoop voor beeldvorming FITC bloei.
2. Selecteer een regio af te beelden en het verwerven van beelden met een snelheid van 1/minuut met behulp van beeld acquisitie software.
3. Begin infusie van FITC-dextran 20 kD (0,5 mg / ml) met de spuitpomp. Fluorescentie in de bloedvaten zal geleidelijk toenemen en een maximum bereiken. Continue infusie gedurende 60 minuten.
4. Ga dan verder met Ringer's infuus te wassen luminale fluorescentie. Handhaaf infuus voor meer dan 10 minuten. Doorgaan beeldaanwinst bij 1/min tijdens wash-off.

6. Beeldanalyse

1. Open de afbeelding overname bestand.
2. Plaats regiovan rente over microvessels binnen het beeldkader.
3. Speel het beeldbestand frame-per-frame en noteer de fluorescentie-intensiteit bij elke regio van belang voor alle frames.
4. Plot de verandering in fluorescentie-intensiteit voor elk gebied van belang als een functie van de tijd.
5. Kwantificeren van de maximale fluorescentie-intensiteit en de resterende fluorescentie-intensiteit na 10 min. van washoff.
6. Bereken de verhouding van de maximale resterende fluorescentie intensiteit bij elk gebied van belang om de permeabiliteit index voor haarvaten verbonden met dat gebied plaats krijgen.

Representative Results

Geïsoleerd bloed geperfundeerd long preparaat verbonden met de perfusieslang en aanverwante apparatuur wordt getoond in figuur 2. Ter demonstratie, gebruikten we een Sprague Dawley rat, hoewel de hierin beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt met elke soort ratten. Infusions via een linker atrium microkatheter bereikt slechts een klein gebied van de long. De toegediende regio kan worden geïdentificeerd door de infusie veroorzaakte verkleuring (figuur 3). De long preparaat gepositioneerd voor real-time imaging wordt getoond in figuur 4.

Figuur 2. Geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding. Foto toont geïsoleerde rat longen aangesloten op de perfusieslang en geperfuseerd met autoloog bloed. Merk op dat het middenrif oppervlak van de long wordt geconfronteerd met de microscope doelstelling.

Figuur 3. Microcatheter infusie regio. Een microcathether ingebracht via de linker atrium werd gebruikt om Ringer-oplossing doordringen in de longen voorbereiding. Foto toont de regio linkerlong (cirkel) ontvangen van de Ringer-infusie. Als Ringer infusie verplaatst het perfuseren bloed door de vaten, wordt toegediend bleek de regio ten opzichte van de andere longgebieden. Merk op dat de Ringer-infusie wordt beperkt tot een klein afgebakend gebied van de long.

Figuur 4. Imaging positie voor gïsoleerde voorbereiding. De foto shows een gïsoleerde voorbereiding gepositioneerd onder een microscoop doelstelling klaar voor de beeldvorming. Merk op dat de long oppervlak is bedekt met een plastic folie aan de long oppervlak vochtig te houden. Een O-ring handhaaft de long oppervlak horizontaal tijdens de beeldvorming.

In deze studie hebben we vastgesteld veranderingen in vasculaire permeabiliteit als reactie op behandeling met bacteriële lipopolysaccharide (LPS, serotype 0111: B4), een veel gebruikte model van ALI. Tegen deze wij LPS toegediend (100 ug / ml) in microvaatjes gedurende 30 min gevolgd door een Ringer-wash 60 min ^11. Dan geïnfundeerd we FITC dextran 20 kD tot de permeabiliteit index kwantificeren. Residuele FITC fluorescentie was laag in haarvaten behandeld met Ringer's, maar hoog in die behandeld werden met LPS (figuren 5A-D). Bovendien, vergeleken met Ringer's infusie, infusie LPS veroorzaakte een significante vermindering van permeabiliteit index duidt op een wereldwijde toename van permeabiliteit in alle bakken in het beeld field (Figuur 5E). De permeabiliteit index afzonderlijk gekwantificeerd venulen en haarvaten suggereerde dat de LPS-geïnduceerde permeabiliteit toename was venulen lager dan in haarvaten, maar het verschil was niet significant (Figuur 5F).

Figuur 5. LPS verhoogt de vasculaire permeabiliteit. Pulmonale microvaatjes werden behandeld met Ringer's of LPS (100 ug / ml) gedurende 30 minuten. Na 60 min werd FITC dextran 20 kD toegediend, gevolgd door een Ringer's wassen en de fluorescentie veranderingen opgevangen door real-time beeldvorming. Dan is de permeabiliteit index van bloedvaten in het behandelde gebied van de long werd bepaald als de verhouding van de maximale resterende FITC dextran fluorescentie. AD) Foto's tonen maximum (A, C) en overblijvende (B, D) FITC fluorEscence in Ringer's-(A, B) en LPS-behandelde (C, D) long haarvaten. E) LPS infusie daalde de permeabiliteit index aanzienlijk in alle segmenten vaartuig binnen het beeldkader. F) LPS behandeling, veroorzaakt een vermindering van de permeabiliteit index in zowel venulen en haarvaten (* p <0,05 vergeleken met Ringer-controle; drie keer herhaald elke; gemiddeld ± SEM). Haarvaten (cap) en venulen (VEN) werden geïdentificeerd door tankafmetingen verkregen brightfield beeld gevangen vóór infusie van FITC dextran 20 kD uit. De getoonde afbeeldingen zijn een bijgesneden gedeelte van een 850 x 850 micrometer beeldframe. n = aantal vaartuigen.

Discussion

De geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een eenvoudig hulpmiddel voor het bepalen van de permeabiliteit veranderingen in enkele long haarvaten. Wij pasten deze methode doorlaatbaarheid verandert in reactie op infusies van LPS te bepalen. Onze gegevens suggereren duidelijk dat LPS infusie veroorzaakt een toename van de microvasculaire permeabiliteit. Verder, de gegevens blijkt ook dat permeabiliteit veranderingen geïnduceerd door LPS waren vergelijkbaar in beide venulen en haarvaten. Dus een belangrijk voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om lekkage van afzonderlijke microvaatjes en een wereldwijd netwerk van vaten definiëren. Aangezien deze techniek levert ook globale doorlaatbaarheid verandert, is het mogelijk deze waarden te vergelijken met die verkregen met andere gebruikelijke werkwijzen, zoals gravimetrie. De onderhavige werkwijze maakt het ook voor de vergelijking van microvasculaire lek informatie die in eerdere studies.

In vergelijking met degrotere schaal gebruikt technieken om vasculaire permeabiliteit veranderingen te bepalen, de real-time imaging-methode vereist geen nabewerking van longweefsel monsters. De mate van retentie fluorofoor wordt vastgelegd tijdens de infusie en daaropvolgende washoff van de fluorofoor. Dit elimineert duidelijk behoud van weefselmonsters en eventuele fouten in verband met hun behandeling. Naast de oprichting van individuele microvessel permeabiliteit via de permeabiliteit index, de huidige methode vergemakkelijkt ook het bepalen van de omvang van de tracer fluorescentie verhoging, de bifasische aard van de snelheid van verandering van tracer fluorescentie, en de snelheid van de tracer fluorescentievervaltijd tijdens afwassen. Deze aanvullende parameters kunnen worden gebruikt om responsen te vergelijken verschillende behandelingen, alsmede inter-segmentale verschillen in microvaatjes, zoals beschreven in onze vorige verslag ^14.

We hebben hierin beschreven procedures permeabiliteit veranderingen vast in reactie op een inflammatoiremiddel door vasculaire infusie geleverd. Het is echter mogelijk om de procedures aan permeabiliteit veranderingen bepalen middelen via andere wegen ook geleverd. Zo hebben we eerder bepaalde microvasculaire permeabiliteit toeneemt tot zuur door alveolaire instillatie ¹⁴ geleverd.

Zoals blijkt uit de foto longen, de microkatheter gebaseerde aflevermethode beperkt het geleverde product aan een klein gebied van de long. Aldus, door het manipuleren van de microkatheter verschillende longgebieden, een reeks experimenten worden uitgevoerd op dezelfde long. Derhalve heeft deze methode een aanzienlijke invloed op het aantal dieren die voor een compleet onderzoek. Gegevens in deze en andere gerapporteerde studies meerdere infusies gebruikt in dezelfde long ^{4,11,12,14,16.} Hoewel er geen verschillen in reacties van de verschillende regio's waren duidelijk vanwege mogelijke recirculatie van de toegediende middelen via het perfusaat in de huidige studie, moet deze mogelijkheid nadelen zijnidered in de experimentele opzet. Dus bij gebruik van verschillende gebieden van dezelfde long voor experimenten, kan het nuttig zijn om te bepalen of basislijn permeabiliteit benadert in verschillende long regio's.

Het succes van de huidige methode hangt sterk af van het opzetten van een goed doorbloed long voorbereiding. De long voorbereiding moeten een uniforme kleur zonder enige rode vlekken, vloeistof die uit de tracheatube, bloed lekken, of hoge drukken in de longslagaders, die allemaal wijzen op een beschadigde long. Verder moet zorg tijdens het inbrengen van de microcathether genomen in de long, als waardoor de insertie leidt tot venule punctie en beschadiging van de longen.

De onderhavige intacte long werkwijze grenzen visualisatie pleurale en subpleural vaten, waardoor aldus permeabiliteit ramingen van slechts een subset van longvaten. Voor visualisatie van diepere vaartuigen kunnen twee-foton microscopische beeldvorming een mogelijk alternatief. Invoegenion van de microkatheter via het linker atrium canule grenzen infusies in venulen en haarvaten in de retrograde richting. Een manier om deze beperking teniet zal zijn om de katheter via de longslagader canule. Als enige wijziging van deze alternatieve procedure is een verlengstuk van de katheter bevestigen op de long inlaatzijde.

Deze procedures zijn ontwikkeld met de ratlong als model. Echter, dezelfde stappen met enkele kleine aanpassingen worden gebruikt om veranderingen in permeabiliteit muizenlong microvaatjes bepalen. Voor muizenlong experimenten, kan de agonist en tracer worden toegevoegd aan het perfusaat en de permeabiliteit gekwantificeerd als vergelijkbaar met die van rattenlongen. Verder kan een andere fluorescentie tracer worden gesubstitueerd om de mogelijkheden van de microscoop gebruiker. De grootte van het dextran-molecuul kan worden gewijzigd afhankelijk van de verwachte omvang van door agonist veroorzaakte permeabiliteit verhogen en moeten besluitengebaseerd op gegevens van eerste experimenten. Dus over het algemeen de gïsoleerde voorbereiding samen met fluorescentie beeldvorming biedt een krachtig hulpmiddel om enkel vat permeabiliteit in standaard diermodellen van ALI bepalen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4