Количественная Single микрососудов проницаемость в изолированном крови-перфузии Rat Подготовка легких

Summary

Выделенный крови перфузии подготовка легких делает возможным визуализировать микрососудов сетей на поверхности легких. Здесь мы опишем подход к количественной проницаемость отдельных микрососудов в изолированных легких использованием изображений в режиме реального времени флуоресценции.

Abstract

Выделенный крови перфузии подготовка легких широко используется для визуализации и определения сигналов в одиночных микрососудов. Объединяя этот препарат с изображениями в режиме реального времени, становится возможным определить изменения проницаемости в отдельных легочных микрососудов. Здесь мы опишем шаги, чтобы изолировать легких крыс и заливать их с аутологичной крови. Тогда, мы наметим шаги, чтобы вселить флуорофоры или агентов через микрокатетера в небольшой области легких. Используя эти методики, описанные, мы определили повышение проницаемости микрососудов в легких крыс в ответ на вливаний бактериального липополисахарида. Данные показали, что липополисахарид увеличился утечки жидкости через обе венулярный и капиллярная микрососудов сегментов. Таким образом, этот метод позволяет сравнить ответы проницаемости среди сосудистых сегментов и, таким образом, определить любое гетерогенность в ответе. В то время как часто используемые методы, чтобы определить проницаемость легких требуют постобработки образцов легочной ткани,Использование визуализации в реальном времени это требование исключает Как видно из настоящего способа. Таким образом, изолированные подготовка легких в сочетании с изображениями в реальном времени имеет ряд преимуществ перед традиционными методами для определения легких микрососудов проницаемость, но это простой способ для разработки и реализации.

Introduction

Увеличение микрососудов проницаемость в легких приводит к развитию альвеолярного отека и скомпрометированной газообмена и является основной характеристикой острого повреждения легких (ALI) ^1-3. Таким образом, оценки проницаемости сосудов играют важную роль в определении степени повреждения легких и эффективности предложенных терапевтических вмешательств. Гравиметрического анализа, таких как кровяное бесплатно легких мокрого на сухой отношение и коэффициента фильтрации микрососудов широко используются методы для оценки проницаемости ^4,5. Другие способы включают количественное определение удержание радиоактивных или флуоресцентных зондов в легочной ткани ^6-8. Однако, эти методы требуют postexperiment обработку образцов легочной ткани на выяснение данных проницаемости. Кроме того, поскольку одно животное может быть использован только для одного протокола лечения, большое количество животных могут быть необходимы для полного исследования. Общей характеристикой описанных выше способов является то, что они определяют среднюю сосудистую проницаемость длявсе кровеносные сосуды внутри образца ткани. Тем не менее, хорошо известно, что легочные микро-и макро-сосуды фенотипически отличается ^9. Таким образом, ответы проницаемости может быть гетерогенным среди различных сегментов сосудов, а ^9,10. Таким образом, количественного среднее проницаемость всех легочных сосудов в образце ткани не могут адекватно отражать эту неоднородность.

В изолированной перфузии кровью подготовки легких, кровеносных сосудов на поверхности легких могут быть визуализированы с помощью вертикального микроскопа, ^4,11,12. Это позволяет, характеризующие ответы в одиночных судов и, таким образом, решения любых гетерогенность в ответах ^13. Кроме того, с использованием флуоресцентной визуализации микрососудов, флуоресцентные анализы на основе могут быть включены. Кроме того, левого предсердия Микрокатетер могут быть использованы для доставки агентов и флуоресценции зондов в кровеносные сосуды ^11,14. Микрокатетер ограничивает доставку в небольшой области легких, таким образом, экссоздает только кровеносные сосуды внутри региона к инфузии агентов и флуорофорами. Это позволяет использовать несколько небольших регионов в рамках одной легких, которые будут использоваться для отдельных экспериментов, что привело к общему снижению животных, необходимых для исследования.

Изображений в режиме реального времени позволяет захват динамических изменений в сосудистой и внесосудистой флуоресценции одиночных микрососудов изолированной подготовки легких. Таким образом, для каждого микрососудов в пределах области изображения, изменения флуоресценции во время инфузии флуорофоров и washoff могут быть записаны, и количественно в автономном режиме ^14. Использование значений максимальной и остаточной флуоресценцией сосудов, индекс проницаемости для каждого микрососудов в области формирования изображения может быть определена. Для определения изменения проницаемости в ответ на воспалительные или вредных веществ, требуемый агент может быть введен, а затем индекс проницаемости определен. Кроме того, поле изображения может быть установлен в любом месте в пределах области легких учитывающеймикрокатетер, таким образом обеспечивая высокую степень гибкости в выборе нужную сеть сосудов. Таким образом, изолированные крови перфузии подготовка легких в тандеме с изображениями в реальном времени обеспечивает привлекательный экспериментальную модель для количественной проницаемость в единичных микрососудов легких.

Protocol

Все эксперименты, проведенные на животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Теннесси Научного центра здоровья на.

1. Шланги для препаратов перфузии легких крыс

1. Подготовьте систему труб с Tygon трубки (# 18) для перфузии крови, как показано на рисунке 1. Подключите датчики давления (P23XL) и поместите трубку на столик микроскопа.
2. Установите температуру водяной бане до 37 ° C.
3. Подключите вход легких и выходе временно с Tygon трубки.

Рисунок 1. Перфузии трубки крови. Схема показывает установку труб используется для циркулирующей крови через изолированном препарате легких. Кроме того, указывается, связаны компоненты, через которые я трубкис разгромлены. Схематическое изображение сердца и легких входит показать сайты связи между НКТ и легочной артерии (ПА), и левого предсердия (LA) канюли (синий пунктир).

2. Подготовка изолированных легких крыс

1. Обезболить крыс (самцов крыс Sprague-Dawley; 250-300 г) с кетамином (80-100 мг / кг) и с ксилазином (5-10 мг / кг). Убедившись, хирургическую плоскость анестезии, место животного в лежачем положении.
2. Выполните трахеостомию, вставить трахеи канюли (PE-90) и закрепите хирургического шва.
3. Настаивать гепарин (100-200 U) в сердце путем сердечной пункции (21 G бабочка иглы), ждать 60 секунд и обескровить крови (~ 12-15 мл крови).
4. Приготовьте два канюли (Tygon трубок, диаметр 3 мм; длинные 4 см; расклешенные на одном конце) и залейте раствором.
5. Выполните торакотомию. Сделайте надрез (3 мм) на правый желудочек и сдвиньте расширяющийся конец канюли в разрез по направлению к легочнымартерии. Безопасность канюли для легочной артерии с хирургических швов.
6. Надрезать (3 мм) вершины левого желудочка и сдвиньте расширяющийся конец второго канюли в разрез. Руководство канюли в левое предсердие. Безопасность канюли для левого желудочка с пупочной ленты (2 мм ширина).
7. Проанализируйте любой соединительной ткани, и удалить легкое и сердце вместе с прилагаемыми канюли. Наведите легких и сердце на чашке Петри. Установите на легких, так что диафрагмальная поверхность находится на вершине. Три канюли должны в том же направлении.
8. Поместите подготовку легких на сцене, которой можно манипулировать в направлениях XY. Любой этап, который поставляется с микроскопом могут быть изменены, чтобы держать трубку или на заказ этап построен, если это необходимо.

3. Крови перфузии изолированных легких крыс

1. Смешайте обескровлены кровь с равным объемом альбумина (5%) раствора и добавить в резервуаре. Запустите перистальтический насос и установить потока гели до 14 мл / мин. Разрешить крови, чтобы заполнить трубопровод.
2. С шунт открыт, выньте разъем на входе-выходе временное легких. Прикрепите легочной артерии и левого предсердия канюли к входу легких и выходе, соответственно. Убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха в трубке.
3. Подключите трахеи канюли с третьим датчиком давления (P23XL). Накачать легкие с 30% кислорода через трахеи канюли и поддержания давления в 5 см H ₂ O.
4. Закройте шунт с зажимом, чтобы начать легких перфузии. Поддерживать легочной артерии и левого предсердия давлений при ~ 10 и 3 см Н ₂ О соответственно.

4. Подготовка Lung для микрососудистой инфузии

1. Поднимите задний конец трубки расширения для выше уровня легких и безопасного катетера.
2. Приготовить настой катетер, вставив около 30 см длинной 40 см ПЭ10 трубы в ~ 30 см длинной трубки PE90. Подключите подвергается конец трубки ПЭ10 к игле (30 г) приприсоединенной к шприцу (1 см).
3. Вставьте комбинацию катетера в поднятом заднем конце удлинительной трубки. Руководство комбинацию катетера через левое предсердие и в легкие, пока он не встречает сопротивление. Затем нажмите на катетер PE10 одиночку дальше в легких, пока он не встречает сопротивление. Заметим, что применение чрезмерной силы во время установки катетера повредит легких.
4. Заполните 1 куб шприц с раствором Рингера и приложить к шприцевой насос. Установить скорость инфузии до 10 мкл / мин.
5. Настой сайт станет бледно по сравнению с остальной частью легких.
6. Смочите легких физиологическим раствором и покрыть легких полиэтиленовой пленкой с отверстием достаточно большой, чтобы оставить место инфузии непокрытой.
7. Тампон некоторое краном жир на нижней части уплотнительного кольца (заказ) и поместите стеклянную покровное (# 1.5, диаметр 22 мм) на дне уплотнительного кольца. Аккуратно поместите уплотнительное кольцо с покровного стекла на месте инфузии. Закрепите уплотнительное кольцо со стандартным пробирки праздникипроизводная Покровное / уплотнительное кольцо сочетание не искажает альвеолярные структуры под ним, как недавно сообщили ^15.
8. Установите цель (20X) из флуоресцентного микроскопа над уплотнительным кольцом и сосредоточиться на поверхности легких.

5. Изображений Люминесцентная Декстран транзитом через микрососудов

1. Подготовьте микроскоп для визуализации FITC цветения.
2. Выберите Ваш регион для включения в образ и получать изображения со скоростью 1/minute с помощью программного обеспечения захвата изображений.
3. Начать вливание FITC-декстрана 20 кДа (0,5 мг / мл) с помощью шприца. Флуоресценции в кровеносных сосудах будет постепенно увеличиваться и достигнет максимума. Продолжить настой в течение 60 мин.
4. Затем переключитесь на вливания Рингера смыть просвета флуоресценции. Поддерживать настой в течение более 10 мин. Продолжить получения изображений при 1/мин во смыва.

6. Анализ изображений

1. Откройте файл получения изображений.
2. Место регионыпредставляющего интерес, за микрососудов в кадре изображения.
3. Играть файл изображения кадр за кадром и записывать интенсивность флуоресценции в каждой области интереса для всех кадров.
4. Участок изменение интенсивности флуоресценции для каждой области, представляющей интерес как функции времени.
5. Количественно максимальной интенсивности флуоресценции и интенсивность флуоресценции остаточного После 10 мин washoff.
6. Рассчитать отношение максимум интенсивности остаточного флуоресценции при каждой интересующей области для получения индекса проницаемости для микрососудов, связанных с этим интересующей области.

Representative Results

Изолированная крови перфузии легких препарат подключен к трубопроводу перфузии и соответствующего оборудования показан на рисунке 2. Для демонстрационных целей мы использовали крысу Sprague Dawley, хотя процедуры, описанные здесь, могут быть использованы с любым видам крыс. Настои через левого предсердия микрокатетера достичь лишь небольшую область легких. Инфузии область может быть идентифицирована путем инфузии, вызванных обесцвечивание (рис. 3). Препарат легких как подходит для визуализации в реальном времени показан на рисунке 4.

Рисунок 2. Изолированные крови-перфузии подготовки легких. Фотография показывает отдельные легкие крыс, связанных с трубкой перфузии и озарен аутологичной крови. Обратите внимание, что диафрагмальная поверхность легкого сталкивается с мимикроскопе цель.

Рисунок 3. Микрокатетер настой область. Microcathether вставляется через левое предсердие был использован, чтобы вселить раствор Рингера в подготовке легких. Фотография показывает область левого легкого (круг), получающего настой Рингера. Как вливания в Рингера вытесняет кровь перфузии через сосуды, проникнуты область выглядит бледным по сравнению с другими регионами легких. Следует отметить, что вливание Рингера ограничено небольшой четко разграничены области легких.

Рисунок 4. Позиция изображений для изолированного подготовки легких. На фотографии шоWS изолированным подготовка легких расположены под микроскопом объективной готовности для работы с изображениями. Обратите внимание, что поверхность легких покрыта пластиковой пленкой, чтобы сохранить поверхность легких влажные. Уплотнительное кольцо обеспечивает поверхностную легких во время съемки в горизонтальном положении.

В этом исследовании, мы определили изменения в сосудистой проницаемости в ответ на лечение с бактериальным липополисахарида (ЛПС; серотипа 0111: B4), широко используемый модели ALI. К этим мы инфузии LPS (100 мкг / мл) в микрососудов в течение 30 мин, после чего мыть Рингера в течение 60 мин ^11. Тогда мы проникнуты FITC декстран 20 кД для количественного определения индекса проницаемости. Остаточный флуоресценции FITC была низкой в микрососудов, получавших раствор Рингера, но с высоким содержанием у пациентов, получавших LPS (фиг.5А-D). Более того, по сравнению с вливанием Рингера, ЛПС настой вызвало значительное снижение индекса проницаемости, что свидетельствует о глобальной увеличение проницаемости во всех судов в пределах изображения Фиэльд (рис. 5E). Индекс проницаемости количественно отдельно для венул и капилляров предположил, что ЛПС-индуцированное увеличение проницаемости был в венулах ниже, чем в капиллярах, хотя различие не было значимым (рис. 5F).

Рисунок 5. ЛПС повышает проницаемость сосудов. Легочные микрососудов лечили либо Рингера или ЛПС (100 мкг / мл) в течение 30 мин. Через 60 мин FITC декстран 20 кДа вводили последующим мытьем Рингера и изменения флуоресценции захваченных изображений в реальном времени. Тогда индекс проницаемость кровеносных сосудов в обработанном участке легких определялась как отношение максимума к остаточной FITC декстрана флуоресценции. AD) Изображения показывают максимум (А, С) и остаточной (B, D) FITC плавиковыйценции в Ringer's-(А, В) и LPS-обработке (С, D) микрососудов легких. Е) ЛПС настой значительно сократилось индекс проницаемости во всех сегментах сосудов в кадре изображения. F) лечение ЛПС вызывает снижение индекса проницаемости в оба венулы и капилляры (* р <0,05 по сравнению с контролем Рингера; повторяли три раза каждым; среднее ± SEM). Капилляры (крышка) и венул (ВЭС) были определены размеров сосуда, полученных из светлого изображения, захваченного перед вливанием FITC декстрана 20 кДа. На иллюстрациях показаны обрезанные часть изображения кадра в 850 х 850 мкм. п = количество судов.

Discussion

Выделенный крови перфузии подготовка легких в сочетании с изображениями в режиме реального времени предоставляет простой инструмент для определения изменений проницаемости в отдельных микрососудов легких. Мы применили этот метод для определения изменения проницаемости в ответ на вливаний ЛПС. Наши данные четко показывают, что ЛПС настой вызвало увеличение микрососудистой проницаемости. Кроме того, данные также показывают, что изменение проницаемости, индуцированную ЛПС были одинаковыми в обеих венул и капилляров. Таким образом, одним из основных преимуществ этого метода является способность определять неплотности одиночных микрососудов, а также глобальную сеть сосудов. Учитывая, что эта методика также дает изменения глобальных проницаемость, можно сравнить эти значения с данными, полученными с помощью других обычно используемых методов, таких как гравиметрического анализа. Таким образом, данный способ также позволяет сравнивать микрососудов утечка информации жидкости с тем, что в других исследованиях.

По сравнению сболее широкое применение методов для определения изменений сосудистой проницаемости, в режиме реального времени метод визуализации на основе не требует постобработки образцов легочной ткани. Степень удержания флуорофора захватывается во время инфузии и последующего washoff флуорофора. Это ясно исключает сохранение образцов тканей и любые ошибки, связанные с их обработкой. В дополнение к созданию индивидуального микрососудов проницаемость через индекс проницаемости, текущий метод также облегчает определение величины индикаторного увеличению флуоресценции, двухфазной природы скорости изменения флуоресценции меченых атомов, и скорость распада примеси флуоресценции при смыть. Эти дополнительные параметры могут быть использованы для сравнения ответы на различных обработок, а также межсегментных различий в микрососудов, как описано в предыдущем отчете ^14.

Мы здесь описаны процедуры для определения изменения проницаемости в ответ на воспалительнуюагент выступил сосудистой инфузии. Тем не менее, можно адаптировать процедуры для определения изменений проницаемости для агентов, поставляемых другими способами, а также. Таким образом, мы уже определяется увеличение проницаемости микрососудов в кислоты, доставляемые альвеолярного закапывания ^14.

Как видно из фотографий легких, микрокатетер основе способ доставки ограничивает Поставляемый продукт в небольшой области легкого. Таким образом, манипулируя Микрокатетер в различных регионах легких, серия экспериментов могут быть проведены в том же легких. Таким образом, этот способ имеет существенное влияние на количество животных, необходимых для полного исследования. Данные в этом и других опубликованные исследования использовали несколько настоев в том же легком ^{4,11,12,14,16.} Хотя никаких различий в ответах из разных регионов не были очевидны в связи с возможным рециркуляции из заваренного агентов через перфузате в настоящем исследовании, эта возможность должна быть минусыidered в экспериментальной конструкции. Таким образом при использовании различных областей одного и того же легкого для экспериментов, может быть выгодно, чтобы определить, является ли базовая проницаемость одинаковой в различных регионах легких.

Успех данного способа в решающей степени зависит создание хорошо перфузии подготовки легких. Препарат легких должна быть однородного цвета без каких-либо красных пятен, жидкость выходит из трахеи трубки, утечки крови, или высоких давлениях легочной артерии, все из которых указывают на поврежденный легкое. Кроме того, следует соблюдать осторожность во время введения microcathether в легкие, как заставляя вставки приведет к венул прокола и повреждения легких.

Настоящий пределы нетронутыми метод легких визуализации плевральной или субплеврально сосудов, и таким образом позволяет оценки проницаемости от только подмножество легочных сосудов. Для визуализации глубоких сосудов, двухфотонная микроскопические изображения может быть возможной альтернативой. Вставитьионный микрокатетера через ушко левого предсердия лимитов канюли вливаний венул и капилляров в ретроградном направлениях. Возможный способ свести на нет это ограничение будет вставить катетер через канюли легочной артерии. Единственное изменение, необходимое для этой альтернативной процедуры для присоединения удлинительную трубку для катетера на впускной стороне легких.

Эти процедуры были разработаны с использованием легких крыс в качестве модели. Однако те же самые шаги с некоторыми незначительными изменениями могут быть использованы для определения изменения проницаемости микрососудов в мышиных легких. Для экспериментов мышей легких, агонист и трассировщик могут быть добавлены в перфузате и проницаемость количественно, как же, как для легких крыс. Кроме того, другая флуоресценции трассировщик могут быть замещены в соответствии возможности микроскопа пользователя. Размер молекуле декстрана может быть изменен в зависимости от ожидаемой величины индуцированного агонистом увеличение проницаемости и должен быть решенна основе данных из первоначальных экспериментов. Таким образом, в целом изолированы подготовка легких вместе с флуоресцентных изображений представляет собой мощный инструмент, чтобы определить единого проницаемость сосудов в стандартных животных моделях ALI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4