Abstract
단일 분자 현미경은 그 부분 (예를 들면., 역학, 다른 주와 인구, 과도 상호 작용의 공존) 일반적으로 앙상블 측정에 숨겨진,, 등에 관한 특히, 신호 분자의 행동을 분석 할 수있는 강력한 방법으로 대두되고 표준 생화학 적 또는 현미경 방법으로 얻은. 따라서, 이러한 수용체 - 수용체 상호 작용과 같은 동적 이벤트는, 높은 시공간 해상도를 가진 살아있는 세포에서 실시간으로 따라야 할 수있다. 이 프로토콜은 작고 밝은 유기 형광체와 직접 살아있는 세포의 표면에 단일 수용체를 시각화하는 전반사 형광 (TIRF) 현미경으로 라벨에 기반 방법을 설명한다. 이러한 접근 방식은 하나가 정확하게 수용체를 지역화 수용체 복합체의 크기를 측정하고, 이러한 과도 수용체 - 수용체 상호 작용과 같은 동적 이벤트를 캡처 할 수있다. 이 프로토콜은 퍼가기하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공샘플 준비, 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함하는 단일 분자 실험을 rform. 예로서, 본 방법의 애플리케이션이 G-단백질 결합 수용체를 분석하기 위해, 즉., 2 - 아드레날린 및 γ-아미노 낙산 타입 B (GABA의 B) 수용체 β,보고된다. 프로토콜은 다른 막 단백질 및 다양한 셀 모델, 형질 감염 방법 및 표지 전략을 적용 할 수있다.
Introduction
세포 표면에있는 수용체는 세포 외 환경을 감지하고 취기 제, 이온, 작은 신경 전달 물질 및 대형 단백질 호르몬 자극 등 다양한 반응한다. 세포막의 유체 특성은 수용체와 다른 막 단백질의 운동을 할 수 있습니다. 이것은 단백질 복합체와 같은 기능 유닛으로 조립하고 세포 내부에 신호를 형질 도입하는 수용체에 의해 사용되는 것과 같은 과도 단백질 - 단백질 상호 작용의 발생의 형성에 필수적이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체 1의 가장 큰 가족을 구성하는 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)는, 신호 전달의 미세 조정 조절에 관여하는 것으로 나타나고 di-/oligomers를 형성하기 위해 제안되었다 중요한 생리 및 약리학 적 결과 2-5가있을 수 있습니다.
단일 분자 현미경 직접 높은 spatiotemp과 시각화의 큰 잠재력을 가지고경구 해상도 그들의 조합을 포함하여 살아있는 세포의 표면에 위치한 각각의 수용체의 동적 거동은 다이머 및 고차 분자 복합체 6-10을 형성한다. 이것은 일반적으로 분자의 수천 또는 수백만의 평균 행동을보고 표준 생화학 적 및 현미경 방법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다.
충분히 밝고 광 안정성과 형광 단백질 라벨은 단일 분자 현미경을 위해 필수적이다. 이 프로토콜은 공유 세포 표면의 수용체에 작고 밝은 유기 형광 물질을 부착 최근에 도입 된 SNAP 태그 (11)을 이용합니다. SNAP는 돌이킬 형광 - 복합 benzylguanine (형광-BG) 파생 상품으로 표시 할 수있는 인간의 DNA 수리 효소 O 6 alkylguanine-DNA의 alkyltransferase에서 파생 된 20 kD의 단백질 태그입니다. CLIP, SNAP에서 파생 된 추가 설계 태그 대신 형광-C로 표시 할 수 있습니다onjugated benzylcytosine 유도체 12.
이 논문에보고 된 프로토콜은 형질 및 레이블 작은 유기 형광 11 수용체를 SNAP-태그와 살아있는 세포 (10)의 표면에 하나의 수용체 나 수용체 복합체를 시각화하기 위해 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 세포 외 SNAP-태그 세포 표면 단백질 10> 90 %의 표지 효율이보고 된 프로토콜 결과. 수용체 복합체의 크기와 이동성을 분석 할뿐만 아니라 과도 수용체 - 수용체 상호 작용을 캡쳐하는 단일 분자 데이터를 사용하는 방법에 대한 추가 정보가 제공된다. 전체 프로토콜의 개략적 인 흐름은도 1에 제시되어있다. 예로 중국 햄스터 난소 SNAP-태그 된 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)와 (CHO) 세포의 형질 감염이 같은 형광 물질 BG 유도체로 라벨링 하였다 잘 자사의 응용 프로그램이 quantif하기Y와 모니터 수용체 di-/oligomerization가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 표면 단백질 및 형광 태그 (예., CLIP), 등 형질 및 표지 방법으로 확장 될 수있다.
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Protocol
1. 샘플 준비
- 커버 슬립 청소
참고 : 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다.- 개별 커버 슬립을 분리하는 커버 슬립 홀더에 유리 커버 슬립 (24mm 직경)를 배치하는 깨끗한 핀셋을 사용합니다.
- 비이커에 커버 슬립으로 홀더를 넣고, 커버 슬립이 덮여 때까지 클로로포름을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 욕조 초음파 처리기에서 증발 및 초음파 처리를 줄이기 위하여 알루미늄 호일로 비이커 커버. 비커 밖으로 커버 슬립 홀더를 가지고 coverslips를 건조 할 수 있습니다.
- 대신 클로로포름 5M NaOH 용액으로 단계 1.1.2를 반복합니다.
- 새로운 비커에 커버 슬립 홀더를 가지고 증류수로 3 회 세척한다. 100 % 에탄올로 가득 유리 세포 배양 접시에서 청소 커버 슬립을 넣어.
- 교정 샘플의 제조
- 적당한 용매에 형광 염료를 녹여.
- 까지 형광 염료의 1:10 시리얼 희석을 준비부터 1 pm 1 nm의 필터 (0.22 μm의) 물을 살균.
- 100 % 에탄올에 저장 청소 커버 슬립을 가지고 필터 멸균 수로 세척. 별도의 청소 커버 슬립의 각 형광 염료 희석 자리 20 μL. 커버 슬립이 멸균 후드 건조시킵니다. 사용할 때까지 빛과 먼지 커버 슬립을 보호합니다. 단일 형광 분자의 강도 (3 단계 참조)을 추정하기 위해이 샘플을 사용합니다.
- 형질
- 1시 1분 둘 베코 변형 이글 배지 / 영양 혼합물 문화 CHO 세포 F-12 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 37 ° C에서 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신,에 보충 (DMEM/F12) . 5 % CO 2 주 : 형광도를 최소화하기 위해 실험을하는 동안 페놀 레드 무료 용지를 사용하십시오.
- , 100 % 에탄올 용액에서 청소 커버 슬립을 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 세척하고, 6 웰 세포 배양 (PL)의 각 웰에 한 커버 슬립을 배치먹었다.
- 를 Trypsinize는 세고 3 × 105 세포 / 웰 커버 슬립을 함유하는 6 - 웰 세포 배양 접시의 밀도로 시드 CHO 세포. 세포가 약 달성하기 위해 24 시간 동안 (37 ° C에서 5 % CO 2) 배양기에서 성장하자. 형질 전환을위한 최적의 세포 밀도 80 % 자랄.
- 각 웰의 경우, (예를 들면., 2 - 아드레날린 수용체 β SNAP-태그) 원하는 플라스미드 DNA의 2 μg을 희석 500 μL의 티멤 매체를 포함하는 두 개의 튜브에서 6 μL의 리포 펙 타민 2000. 실온에서 5 분 동안 품어.
- 하나의 튜브에 단계 1.3.4에서 솔루션을 결합하고 형질 전환 혼합물을 얻기 위해 혼합한다. 20 분 동안 RT에서 형질 감염 혼합물을 배양한다.
- 배양 (1.3.5) 동안, CHO 세포를 가지고 예열 (37 ℃) PBS로 두 번 세척한다. 1 ㎖ / 10 % FBS와 보충 페놀 레드 무료 DMEM/F12 매체의 잘하지만 항생제로 PBS를 교체합니다.
- 전체 형질 추가부드럽게 이온 혼합물 아니라 각 단계 1.3.5 적하에서 (1 ㎖), 그리고 완전한 혼합을 보장하기 위해 앞뒤 판 바위.
- 5 % CO 2, 37 ℃에서 2 ~ 4 시간 동안 배양하고 다음 단계로, 그 후 즉시 진행 참고 :.이 형질 전환 조건에 대한 단일 적합한 수용체 밀도 <0.45 입자 / μm의 2를 달성하기 위해 최적화 된 분자 영상. 다른 세포 구조 나 시약을 사용하는 경우 조정이 필요할 수 있습니다.
- 단백질 라벨
- 1 μM의 최종 농도를 얻기 위해 10 % FBS로 보충 된 1 ㎖ DMEM/F12 배지에서 형광 물질 BG 스톡 용액의 1 ㎕의 희석. 인큐베이터에서 형질 전환 세포를 가지고 예비 가온 (37 ° C) PBS로 두 번 세척한다. 1 μM 형광-BG 용액 1 ㎖의 PBS를 교체하고 인큐베이터에서 37 ° C 5 % CO 2에서 20 분 동안 품어.
- 배양 후, 세포를 세 씻어10 % FBS와 보충 DMEM/F12 매체와 시간마다 37 ℃에서 5 분 인큐베이션 핀셋 (표시 셀) 커버 슬립을 가지고 이미징 챔버에 배치합니다.
- 300 ㎕의 영상 버퍼로 두 번 씻으십시오. 신선한 영상 버퍼 300 μl를 추가하고 영상 (2 부)로 바로 이동합니다.
2. 이미지 획득
NOTE : 전반사 형광 오일 침지 높은 개구 수 대물 (. 예 100X magnification/1.46 개구), 최적의 레이저 (예를 들어, 405 나노 미터, 488 나노 미터, 561 ㎚, 645 탑재 (TIRF) 현미경을 사용 nm의 다이오드 레이저), 전자 곱한 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라, 인큐베이터 및 단일 형광 분자를 시각화하는 온도 제어.
- 원하는 현미경 매개 변수, 예를 설정합니다., 레이저 라인, TIRF 각도 (이 매개 변수에 침투를 제어사라져가는 필드의 기의 깊이), 노출 시간, 프레임 속도 및 영화 (10) 당 이미지 수. 온도 감도는 수분 응축을 방지하기 위해 항상 히터 / 보육 및 온도 제어를 유지합니다.
- 현미경의 100X 목적에 침지 기름 한 방울을 넣어. 현미경의 시편 홀더에 표시된 세포 이미징 챔버를 배치하고 시야 조명을 사용하여 초점 세포를 가져옵니다.
- TIRF 조명으로 전환합니다. 그러나 동시에, 원하는 셀에 대한 검색 광표백을 최소화하도록 가능한 한 낮은 레이저 출력을 유지한다.
- 원하는 셀을 선택하고 정밀한 초점을 조정합니다. 단일 형광의 시각화를 허용 레벨로 레이저 파워를 설정한다. 이미지 시퀀스를 획득. TIFF로 RAW 이미지 시퀀스 파일을 저장합니다.
3. 교정 (유리 및 단량체 / 이량 체 수용체 컨트롤에 단일 형광)
- 각 교정 SAMPL 조립촬상 챔버에서 1.2에 설명 된대로 전자 제조. 현미경으로 각 샘플을 놓고 한 단계 참고로 표백 잘 분리 회절 제한 장소를 포함하는 샘플을 선택합니다.이 반점은 형광 염료의 분자 하나를 나타냅니다.
- 2 단계 설명 TIRF 이미지 시퀀스를 획득 중요. 동일한 촬상 파라미터 보정 것들을 포함한 모든 실험에 사용되어야한다.
- 4.2 - 검색 및 4.1에 설명 된대로 추적 분석을 수행합니다. 4.2.6에 설명 된대로 각 입자의 강도를 추출합니다. 이 데이터에서 평균 (μ)와 하나의 형광 강도의 표준 편차 (σ)를 계산합니다.
- 선택적 : 단량체 세포 표면 수용체 (. 예, CD86)로 형질 감염된 세포에서 동일한 분석을 수행, N-말단은 SNAP (10)의 하나 또는 두 개의 카피로 태그 및 형광 BG-유도체로 표지. FOLLO유리에 하나의 형광 위에서 설명한 절차 w. Calebiro, D. 등의 설명에 따라 라벨 효율을 예상하고있다. 10
4. 이미지 분석
- 이미지 시퀀스 준비
- 이미지를 자르려면 이미지 처리 소프트웨어 (예., ImageJ에)를 사용합니다.
- 별도의 개별 프레임을 저장합니다. TIFF 이미지를 새 폴더에, 각 이미지 프레임 번호를 나타낸다.
- 셀의 형상을 따라 그 (ROI)의 영역을 드로잉하고 ImageJ에있는 공구 측정 또는 다른 소프트웨어에서 유사한 공구를 사용하여 셀 면적을 측정한다. 세포 표면 영역에 의해 동영상의 시작 부분에 입자의 총 개수로 나눔으로써 입자 밀도를 계산하기 위해이 값을 사용한다.
- 입자 검출 및 추적
참고 : 매트랩 작업 등 U-추적 13로 비 상업용 소프트웨어를 사용하여자동으로 감지하고 하나의 수용체 입자를 추적 할 수있는 환경.
참고 : U-트랙 알고리즘은 다중 가설 추적 방식을 기반으로합니다. 이 방법은 한 프레임에 주어진 입자, 다음 프레임에 주어진 입자에 해당하는 표시, 사라 / 또는 다른 입자 /로 분할 병합 개별 확률이 할당되는 비용 행렬을 구축하여 프레임 사이의 입자를 연결합니다. 전 세계적으로 비용을 최소화하는 솔루션은, 즉., 확률이 가장 높은 사람은 마지막으로 선택됩니다. 이는 또한 일시적으로 사라지는 입자, 형광 깜박임 기인 전형적인 현상을 추적한다. U-트랙 (2.1.0)의 최신 버전은 이러한 분석의 실행을 촉진 그래픽 사용자 인터페이스를 가지고 있습니다.- 영화 선택 인터페이스를 열기 위해 Matlab을 명령 프롬프트에서 다음을 입력합니다 "movieSelectorGUI". 을 만드는 지침에 따라이전에 저장 한 별도의 이미지부터 새 영화 데이터베이스 (4.1.2 참조).
- 입자 검출 및 추적에 필요한 화소 크기에서 나노 초 시간 간격, 개구, 카메라 비트 깊이와 형광 물질의 발광 파장을 제공한다. 영화 데이터베이스를 저장합니다.
- 영화 선택 인터페이스에서 객체의 유형으로 "단일 입자"를 선택, 분석을 실행합니다. 입자 탐지 및 추적에 사용되는 매개 변수를 정의 할 수있는 새 창이 나타납니다. 기본 매개 변수로 시작합니다. . 감지 및 / 또는 추적의 품질이 선택 (예를 들어, 일부 입자가 검출이나 트랙이 단편화되지 않습니다) 만족하지 않은 경우 나중에 이러한 매개 변수를 조정합니다 추적 설정에서 저장하는 "매트릭스 형식으로 내보낼 추적 결과를"확인 "trackedFeaturedInfo라는 단일 매트릭스 (필드의 좌표와 모든 입자의 진폭"). 이러한 매개 변수에 대한 자세한 내용은 U-트랙 문서를 참조하십시오.
- 검출 알고리즘을 실행합니다. 이 알고리즘은 자동으로 각 회절 한정 스폿 로컬 강도 맥시마 주위 현미경의 점 분포 함수와 동일한 표준 편차 이차원 가우스 함수 피팅에 의해 (즉. 단일 수용체 / 수용체 복합체)의 배경 위에 위치 및 세기를 결정 . 그 후, 추적 알고리즘을 실행. . 매트 파일의 분석 결과를 저장합니다.
- 트랙을 시각화하고 탐지 및 추적의 품질을 확인하기 위해 U-트랙 패키지에 포함 된 "movieViewer"루틴, 또는 유사한 사용자 지정 것들을 사용합니다.
- 각 프레임에서 추적 입자의 위치와 진폭 (예., 강도)을 볼 수 있도록. 매트 파일을 엽니 다. 4.2.4 단계에서 생성 된 데이터는 tracksFinal 아칸소의 tracksCoordAmpCG 필드에 포함되어 있습니다선 및 / 또는 trackedFeaturedInfo합니다. 입자의 총 개수에서 4.1.3에서 측정 셀 표면적으로 나눈 값이 입자 밀도를 산출 검출.
- 선택적 : 입자가 수용체 입자의 움직임을 분석하는 (4.2.6 참조) 시간의 경과에 위치 사용. Matlab을 유사한 소프트웨어를 사용하여 평균 제곱 변위 (MSD) 및 확산 계수 (D)를 계산한다. 각 입자마다 시간 간격 (Δ의 t)를 고려, 다음과 같은 공식을 사용하여 평균 제곱 변위 (MSD)를 계산 :
Δ의 t 프레임의 시간 간격이고, N 분석 단계의 수이고, x 및 y는 입자의 X 및 Y는 인덱스에 의해 지시 된 프레임에 위치한다. 선형 관계 : 주어진 입자의 운동 종류를 평가하는 시간 플롯 위에 MSD를 사용자유 확산 (예., 브라운 운동), 양의 곡률을 나타냅니다 (즉., 곡선이 포물선 모양) 감독 운동을 제안, 음의 곡률이 제한 운동 (14)을 나타낸다. 자유롭게 확산 입자의 경우, 다음의 식으로 얻어 MSD 데이터 피트에 의해 각 입자의 확산 계수 (D)를 계산한다 :
- 가우스 피팅 방법으로 입자 크기의 계산
NOTE : 보정 샘플 (유리 및 / 또는 형광 표지 된 단량체 성 수용체에 단일 형광체)의 강도 분포를 알면, 수용체 복합체의 크기를 결정하기 위해 이미지 시퀀스의 시작 부분에서의 입자 농도의 분포에 혼합 가우스 피팅을 수행 (예. 입자 당 수용체의 수) 10. Matlab을 또는 s를 사용하여 이러한 분석을 수행imilar 소프트웨어.- 강도의 변화가 제 (photobleaching에 의한 대부분의 경우에 저하)가 발생하기 전에 프레임의 첫 번째 프레임에서의 입자의 강도를 평균하여 각 입자의 강도를 계산한다.
- 다음 식에 따라 혼합 가우시안 피팅을 수행합니다 :
φ (i)는 입자가 나는 강도를 갖는 주파수이고, n은 구성 요소의 수입니다, α N 구성 요소 n의 높이에 기여하는 매개 변수이고, μ와 σ는 평균과 참조 하나의 형광 강도의 표준 편차입니다 . (3 단계에서 설명 된대로 계산) 주 : T를 결정F-검정에 의해 판단으로 그는 점차 구성 요소를 추가 할 때까지 N 최대 증가하여 각 이미지 시퀀스에 대한 구성 요소 (N 최대)의 최대 수는 더 이상 통계적으로 더 나은 피팅을 생산하지 않습니다. - 선택 사항 : (. 예를 들면, 400 프레임 시퀀스의 마지막 60 프레임) 동영상의 마지막 프레임에서 얻어진 강도 분포에 혼합 가우시안 적합을 수행합니다. 이러한 매개 변수에 대한 정교한 예측을 제공하는이 피팅 후의 값, 단계를 반복 4.3.2와 μ와 σ를 교체합니다.
- 혼합 가우스 적당한 각 성분의 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산한다. 다른 크기 분포 전체의 AUC에 의해 각 구성 요소의 AUC 값을 나눔으로써 (즉, 단량체, 이량 체, 삼량 체 등)의 수용체 입자의 상대적인 풍부함을 계산한다.
- 선택 사항 : 다른 세포와 다른 크기와 입자의 분포는 입자 밀도 (10)와 상관 관계 플롯을 생성하는 (4.2.6에 설명 된대로 계산) 해당 입자 밀도에서 사용 데이터.
- 단계 피팅 방법으로 입자 크기의 계산
NOTE : 수용체 복합체 (10)의 크기를 결정하기 위해 다른 방법으로 스텝 - 피팅 분석을 사용한다. N의 형광을 포함하여 입자 점진적으로 표백제 N 단계를 강도 프로파일을 생성 할 것으로 예상된다 -이 분석의 기초는 순간 실종에 하나의 형광 결과의 빛에 의한 파괴 (photobleaching에)가 있다는 것입니다.- U-트랙 또는 유사한 탐지 / 추적 소프트웨어 (4.2.6 참조)에 의해 생성 된. 매트 파일에서 각 입자의 강도 프로파일을 추출합니다.
- 이러한 제시된 하나로서, 스텝 피팅 알고리즘을 사용심판의. 10, 각 입자에 대한 표백 단계의 수를 계산.
- 선택적 : (4.3 참조) 다른 크기의 수용체 입자의 상대적인 풍부함을 나타내는 분포를 생성하고 이전에 혼합 가우스 피팅의 결과에 대하여 기술 된 바와 같이 입자 밀도로 그들을 연관시키는 결과를 사용한다.
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Representative Results
기술 된 프로토콜은 서로 다른 막 단백질의 다양한 적용 할 수있다. 예로서, β-2 아드레날린 성 및 GABA B 수용체로 얻어진 대표적인 결과 (10)를보고한다. 하나의 분자에서 형광 신호가 미약하기 때문에, 배경 형광의 최소화는 성공적인 결과에 대한 첫 번째 중요한 단계입니다. 따라서, 광범위하게 세정 커버 슬립 (도 2A)를 사용하는 것뿐만 아니라, 시료의 autofluorescence (예., 페놀 레드없는 배지를 사용하여)을 최소화하는 것이 중요하다. 다음 단계는 단일 형광 분자의 형광 강도를 결정하는 것이다. 이것은 깨끗한 커버 슬립 (그림 2B)에서 발견 한 형광 이미징하여 수행 할 수 있습니다. 일반적으로 형광의 직렬 희석, 분석을위한 최적의 조건을 선택하는 데 사용됩니다 즉., 잘 분리하고 균일하게 분포 하나의 형광 물질을 생산 농도. 추가 (계속)rols 모노머가 조절 단백질을 묘화에 의해 수행 될 수있다, 예를 들면., 형광 BG-유도체로 표지 NAP-태그 CD86 수용체. 이러한 예비 제어 및 교정이 수행되고 나면, 실제 실험을 시작할 수 있습니다. 그림 3a는 2 - 아드레날린 수용체 β SNAP-태그와 형광-BG 유도체로 표지와 형질 세포의 전형적인 TIRF 이미지 시퀀스의 첫 번째 프레임을 보여줍니다. 반점은 하나의 수용체 나 수용체 복합체를 나타냅니다. 이 이미지는 또한 자동 검출 및 추적을위한 적절한 입자 밀도를 보여 -. 우리의 경험에 따라, / μm의 불량 추적 품질 및 10 피해야에서이 결과 0.45 입자 위 밀도도 3b는 동일한 적용 검출 알고리즘의 결과를 나타낸다 이미지 시퀀스. 각 파란색 원은 검출 입자를 나타냅니다. 추적 알고리즘의 결과는,도 3c에 나타내었다블루 스플라인은 개별 입자의 궤적을 나타내는 곳. 각 입자의 궤적은 그 확산 계수를 계산하는 데 사용될 수있다. 이 방법은 또한 2 개의 입자가 명백하게 과도 상호 작용을 거쳐도 3d에 도시 된 바와 같이, 동적 이벤트를 캡처한다.도 4 개의 서로 다른 GPCR에, 즉 측정 확산 계수의 분포를 나타낸다., 2 - 아드레날린 및 GABA B 수용체 β. 이러한 유형의 분석은 우리가 GABA B 수용체의 많은 부분이 움직이지 않거나 매우 낮은 이동성 (10)를 가지고 있음을 보여주고 있었다. 혼합 가우시안 피팅 및 스텝 피팅 분석은 살아있는 세포의 표면 (그림 5)에서 수용체 복합체의 크기의 정확한 정량을 제공합니다. 이 분석은 또한 예를 들어, 복잡한 분포를 밝힐 수있다., 단량체 및 이량 체의 공존은도 5a의 예와 같이.그림의 (b) (c)는, 하나 또는 두 개의 단계를 올바르게 각각 단량체와 이량 체 수용체로 할당 대응 단계 맞는 분석 표백 입자의 두 가지 예제를 제공합니다.
이 프로토콜에 설명 된대로 일반적인 단일 분자 실험의 그림 1. 워크 플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. coverslip에 청소 및 교정 시료의 준비. (A)광범위한 커버 슬립 청소 전후의 배경 형광의 비교. 커버 슬립이 TIRF 현미경으로 몇 군데 있었다. (B) 청소 커버 슬립에 발견 형광-BG 유도체의 농도를 증가의 TIRF 이미지. 스케일 바 :. 10 ㎛가 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 일반적인 단일 분자 이미지 및 탐지 / 추적 알고리즘의 결과. (A) 2 - 아드레날린 수용체 β SNAP-태그와 형광-BG 유도체로 표지 형질 전환 된 CHO 세포는 TIRF 현미경으로 시각화했다. 취득 된 화상 시퀀스의 첫 번째 프레임은 표시합니다. 스케일 바 :. 5 μm의 (B)0; 감지 입자는 원래 이미지의 상단에 파란색 원으로 표시되는 (C) 같은 이미지 시퀀스 추적 알고리즘의 적용으로 인해 궤도는 흰색 배경에 나타낸다.. 스냅 샷은 프레임 없음의 상황에 해당합니다. 35. 그린 세그먼트, 이벤트를 병합. 레드 세그먼트 분할 이벤트. (D)는 두 수용체 입자로부터 얻은 대표적인 궤적 (파란색과 녹색, 각각), 명백한 과도 상호 작용 (적색) 진행. 두 입자가 여러 프레임을 위해 함께 이동, 병합, 다시 분할합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수용체 MOBILI의 그림 4. 분석TY. 개별 입자의 궤적은 그 확산 계수를 계산하는 데 사용된다. 이 예에서, 두 개의 서로 다른 GPCR에 대해 계산 된 확산 계수의 분포가보고된다. GABA B 수용체의 이동성을 제한하는 반면 β-2 아드레날린 성 수용체는 세포 표면상의 빠른 횡 방향 확산에 의해 특징 지어진다. Calebiro, D. 등. (10)에서 수정
수용체 복합체의 크기의 그림 5. 분석. (A) 수용체 복합체의 크기는 정확하게 가우시안 혼합 모델과 입자 농도의 분포를 피팅함으로써 추정 될 수있다. 보고 된 예는 2 drenergic 수용체 β SNAP-태그를 발현하는 세포에이 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다. 피팅은 두 개의 C를 보여omponents : 하나의 형광의 강도에 대응하는 하나 (교정 샘플의 그것뿐만 아니라 샘플의 부분 표백 후의 분포에 크게 겹쳐, 여기에 표시), 약 두 배의 강도를 가진 하나. 두 구성 요소는 각각의 단량체 및 이량 체로서 할당 될 수 있고, 두 개의 구성 요소 아래 영역 모노머와 다이머 수용체의 상대적인 풍부함을 추정하는데 사용될 수있다. 한 단계에서 단량체 성 수용체 입자 표백 (B) 실시 예. (C 특성상 두 단계 표백과 다이머 수용체 입자) 실시 예. (B) 및 (C)에있는 적색 라인 스텝 피팅 알고리즘의 결과이다. 그림이 Calebiro, D. 등에서 수정되었습니다. 10 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명 프로토콜은 단일 분자 수준에서 공간 배열, 이동성과 세포 표면 수용체 복합체의 크기를 분석 할 수 있습니다. 형광 단백질의 사용에 비해 더 밝고 광 안정성이다 작은 유기 형광체와 라벨은 단일 수용체 입자의 확장 된 시각화를 허용하는 장점을 갖는다. 매우 낮은 발현 수준이 달성되기 때문에 (<0.45 수용체 입자 / 2 ㎛)을, 수용체 및 기타 막 단백질의 생리 학적 특성은 사람을 초과하지 않는 밀도에서 분석 될 수있다. 또한, 효능 제 (10) 또는 다른 조작과 수용체 자극의 효과는, 예를 들어 병리학 적 상황을 재현을 목표로 분석 할 수있다. 또한, 때문에 SNAP / CLIP 태그 (11, 12)와 라벨 전략의 유연성, 다른 형광체는 하나의 특정 요구에 따라 사용할 수 있습니다 - 눈에 띄게, SNAP의 조합및 CLIP 태그는 두 색 실험 예를 수행하는데 사용될 수있다.,이 상호 작용하는 단백질 사이 colocalization을 관찰하기. 마지막으로,이 프로토콜은 상이한 세포 형질 감염 방법 및 표지 전략을 사용하여, 예를 들어, 몇개의 점에서 수정 될 수있다.
중요한 단계는 매우 낮은 발현 수준을 달성하기 위해 (광범위 세정 커버 슬립, 페놀 레드없는 배지 및 여과 용액을 사용하여) 배경 및 형광도의 최소화 (형질 감염 후 예., 플라스미드 DNA의 양 및 시간) 형질 전환 조건의 최적화를 포함 효율적인 라벨과 밝은 충분히 광 안정성 형광의 선택. 세포의 형광도는 가시 스펙트럼과 550 nm의 위 일반적으로 거의 무시할의 블루 / 그린 부분 높기 때문에 형광의 선택에 관하여, 원적외선 / 붉은 색은 일반적으로 더 나은 결과를 제공합니다. 특별한주의는 광표백의 피에 지불해야한다적절한 세포 및 초점 조정에 대한 검색하는 동안 형광. 유리 커버 슬립에서 목격 형광체뿐만 아니라 단량체 및 이량 체 수용체 컨트롤 샘플 (예., CD86은 하나 또는 두 개의 SNAP 태그로) (10)은 분석을 교정하고 표지 효율을 확인하기 위해 고려되어야한다.
이 방법의 한계는 현재 달성 될 수 시공간적 해상도에 크게 의존한다. 이것은 주로 한 형광체로부터뿐만 아니라 사용되는 카메라의 감도 및 수집 속도로 수집 광자의 개수에 의해 결정된다. (- 300 nm의 비교를 위해 기존의 형광 현미경의 공간 분해능은 약 200) 30 뉴 멕시코 - 하나의 검출 입자의 현지화 정도에 대한 일반적인 값은 20이다. (- 13 nm의 약 2)이 값은 여전히 전형적인 세포막 단백질의 실제 크기보다 더 크다. 수용체 마이크로의 회절 한계 이하의 거리로 떨어지는시기범위 (약 200-300 nm의)는 하나의 입자로 감지되고, 적절한 관리 및 통계 분석은 사실 수용체 - 수용체 상호 작용 8 ~ 10의 수에서 임의의 colocalizations (가양) 빼기에 사용하는있는 최대한의 수집 속도 달성. 현재 EMCCD 카메라는 적어도 하나 자르기 모드 KHz에서 (즉., 센서의 일부만이 사용된다)를 초과 할 수있다. 그러나, 수집 속도는 카메라에 도달 한 형광 물질에 의해 방출되는 광자의 수에 의해 제한된다. 실제로, 적어도 (10)의 노출 시간 - 20 밀리 일반적 필요하다. 이러한 이유로, 일반적인 수집 속도는 10, 50 Hz에서, 즉 사이에 다릅니다., 하나의 프레임마다 20-100 밀리 초. 형광 디자인, 광학 부품 및 탐지 기술의 미래 발전은 더 이상 단일 분자 방법의 시공간적 해상도를 증가 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
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