受体动力学通过单分子荧光显微镜的高分辨率时空分析
2014年7月25日
该协议描述了如何使用全内反射荧光显微镜来可视化和跟踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体横向移动性、受体复合物的大小以及可视化瞬时受体-受体相互作用。该方案可以扩展到其他膜蛋白。
以下实验的总体目标是可视化活细胞表面的单个受体，并分析它们的位置、运动和动态关联为超分子复合物。这是通过在活细胞表面以非常低的水平表达卡扣标记受体并用明亮的有机荧光团标记它们以允许单分子检测来实现的。作为第二步，通过全内反射荧光显微镜观察细胞，这允许获得在细胞表面移动的单个受体颗粒的快速图像序列。
接下来，将自动检测和跟踪算法应用于图像序列，以获得每个受体粒子随时间的位置和强度。获得的结果表明，对受体复合物的大小进行了精确分析，在本例中，β 两个肾上腺素能受体基于图像序列开始时颗粒强度分布的混合高斯拟合。这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，例如我们的受体如何在活细胞表面的 od 结构域中组织。
它们如何相互作用形成二聚体和寡聚体，以及基于受体信号转导的动态事件实际上是如何发生的。与标准生化和显微镜方法相比，该技术的主要优点是它研究了自然环境中单个受体的行为，从而使我们能够研究通常隐藏在集成测量中的重要方面。样品的盖玻片必须进行广泛清洁，以尽量减少背景荧光 在成像过程中，使用干净的镊子放置直径为 24 毫米的镊子。
玻璃盖滑入盖玻片架中，该盖玻片架将各个盖玻片分开。将带有盖玻片的支架放入烧杯中，加入氯仿，直到盖玻片盖上。用铝箔盖住烧杯以减少蒸发并在浴中超声处理。
在室温下超声处理 1 小时。一小时后，从烧杯中取出盖玻片架，让盖玻片干燥。接下来，将带有盖玻片的支架放入另一个烧杯中，加入 5 摩尔氢氧化钠溶液，直到盖玻片被盖住。
和以前一样，用箔纸盖住烧杯，在室温下超声处理 1 小时，将盖玻片架转移到新的烧杯中，用蒸馏水洗涤 3 次。最后，将清洁的盖玻片放入装有 100% 乙醇的玻璃细胞培养皿中。此处显示的是清洁前后的盖玻片，通过全内反射荧光或草皮显微镜成像。
校准样品用于估计草坪显微镜检查期间单个荧光分子的强度。要制备样品，请将荧光染料溶解在适当的溶剂中。准备 1 到 10 次连续稀释的荧光染料，范围从 1 皮卡摩尔到 1 无磨牙。
在过滤灭菌水中。将先前清洁的盖玻片转移到装满过滤无菌水的细胞培养皿中，清洗这些盖玻片。之后，将每个盖玻片放入六孔细胞培养板的孔中，并等待它们干燥，将 20 微升每种荧光染料稀释液放在单独的清洁盖玻片上。
让盖子在无菌罩下滑干。转染前，请保护盖玻片避光和防尘。准备一个 6 孔细胞培养板 用无菌 PBS 清洗清洁的盖玻片，然后将一个盖玻片放入 6 孔细胞培养板的每个孔中。
将要转染的 CHO 细胞在 37 摄氏度、5% CO2 中培养在一种一对一 ECCO 改良的鹰培养基营养混合物 F 12 中，胰蛋白酶后补充有 10% 胎牛血清青霉素和链霉素，并按照标准方法计数细胞，以 3 倍 10 的密度接种至每孔第五个细胞。在包含盖玻片的第六孔细胞培养板中，让细胞在培养箱中生长 24 小时，以达到大约 80% 的 co fluency，这是最佳细胞密度。用于转染。
该方案最困难的方面是实现细胞表面膜受体的极低表达水平以确保成功。转染条件。例如，加培养基的量 NA 和转染后的时间必须在转染当天进行优化。
制备每种转染试剂将在另一管中的 500 μL 最佳培养基中稀释 2 μg 所需的 plaid DNA。对于每个孔，在 500 微升 Optum 培养基中稀释 6 微升 Lipectomy 2000。将两个试管在室温下孵育 5 分钟。
5 分钟后，将两种溶液混合到一个试管中并混合以获得转染混合物。将转染混合物在室温下孵育 20 分钟。同时，准备 CHO 细胞。
用预先警告的 PBS 洗涤细胞两次 第二次洗涤后，用每孔 1 毫升不含酚红的 D-M-E-M-F 12 培养基替换 PBS，补充有 10% FBS，但不含抗生素。向每个孔中逐滴加入 1 mL 转染混合物，轻轻来回摇动板以确保完全混合。在 37 摄氏度下在 5% CO2 中孵育 2 到 4 小时，然后立即进行蛋白质标记。
要开始此过程，在补充有 10% FBS 的一毫升 D-M-E-M-F 12 培养基中稀释一微升氟四共轭苯并桂衍生物或氟四 BG 储备溶液，以获得一微摩尔的最终浓度。从培养箱中取出转染的细胞，并用预热的 PBS 洗涤两次。用 1 毫升 1 微摩尔氟四 BG 溶液替换 PBS，并在 37 摄氏度下在 5% CO2 中孵育 20 分钟。
接下来，用添加 10% FBS 的 D-M-E-M-F 12 培养基洗涤细胞 3 次，然后在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。使用镊子将带有标记细胞的盖玻片转移到成像室。用 300 微升成像缓冲液洗涤两次。
加入 300 微升新鲜成像缓冲液，并立即进行成像图像采集。使用配备油浸、高数值孔径物镜、合适激光器、电子倍增电荷耦合装置、相机和培养箱以及温度控制器的草坪显微镜。设置所需的显微镜参数，即激光线、草皮角度、曝光时间、帧速率和每个电影的图像数。
将一滴浸油滴在显微镜的 100 x 物镜上。将带有标记细胞的成像室放在显微镜的标本架上，并使细胞聚焦。使用明场照明。
切换到草坪照明。保持尽可能低的激光功率以允许搜索所需的细胞，但同时最大限度地减少照片漂白。选择所需的单元格并微调。
调整焦距。将激光功率提高到允许可视化单个 Flora 4 的水平。获取图像序列并将 Raw 图像序列另存为 tiff 文件以进行校准。
将每个校准样品组装在成像室中并放在显微镜上。选择包含分离良好的衍射的样品。一步漂白的有限斑点。
随后以与标记细胞相同的方式获取 Turf 图像序列。要准备图像序列，请使用 Image J 等图像处理软件裁剪图像。将各个帧作为单独的 TIFF 图像保存在一个新文件夹中，并指示每个图像上的帧编号。
粒子检测和跟踪是在 MATLAB 环境中使用 U Track 等非商业软件执行的。在 MATLAB 命令提示符下，键入影片选择器 GUI。要打开影片选择界面，请按照说明从之前保存的单独图像开始创建新的影片数据库。
提供粒子检测和跟踪所需的荧光团的像素大小（以纳米为单位）、以秒为单位的时间间隔、数值孔径、相机位深度和发射波长。从影片选择界面保存影片数据库。选择单个粒子作为对象类型运行分析。
运行检测算法，然后运行跟踪算法。使用 URAC 包中包含的电影查看器例程来可视化轨道并检查检测和跟踪的质量。打开点 MAT 文件，查看每帧被跟踪粒子的位置和振幅。
颗粒的大小也可以根据获得的数据计算出来。此处显示的是用 snap 标记的 β 2 肾上腺素能受体转染并用氟 4 偶联的 benzyl guine 衍生物标记的细胞的典型 Turf 图像序列的第一帧。这些斑点代表单个受体或受体复合物。
检测算法应用于同一图像序列，每个检测到的粒子都由跟踪算法的蓝色圆圈应用程序表示。对于相同的图像序列，将产生以蓝色表示的单个粒子的轨迹。绿色 Segment 表示合并事件，红色 Segments 表示拆分事件。
此方法还捕获动态事件。在此示例中，两个粒子经历瞬态交互，一起移动了几帧，然后再次分裂。单个粒子的轨迹用于计算它们的扩散系数。
这一代表性结果表明 β 2 肾上腺素能受体具有高迁移率。虽然 gaba B 受体的迁移率有限，但可以通过用混合高斯模型拟合粒子强度的分布来精确估计受体复合物的大小。该分析还可以揭示单体和二聚体的共存。
这里显示的是单体受体颗粒一步漂白和直径受体颗粒两步漂白的例子。这些程序可以扩展和适应其他细胞表面蛋白、流平方法和细胞模型。看完这个视频，你应该对如何产生干净的覆盖睡眠，如何获得低表达水平和用明亮的有机荧光进行有效标记，以及如何获取和分析草坪图像，这些图像代表了成功的单分子的所有关键步骤。
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概述
本协议描述了一种使用全内反射荧光显微镜在活细胞表面上可视化和跟踪单个受体的方法。它允许分析受体的移动性、复合物大小和短暂的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
- 受体动力学
背景
- 理解受体组织对于细胞生物学至关重要。
- 单分子检测提供了对受体行为的见解。
- 受体可以形成影响细胞功能的超分子复合物。
- 全内反射荧光显微镜是一种强大的成像技术。
研究目的
- 在活细胞表面可视化单个受体。
- 分析受体运动和动态关联。
- 调查细胞膜中受体的组织。
使用的方法
- 在细胞表面低水平表达snap标记的受体。
- 用明亮的有机荧光团标记受体以便检测。
- 利用全内反射荧光显微镜进行成像。
- 应用自动检测和跟踪算法进行分析。
主要结果
- 使用高斯拟合对受体复合物大小进行精确分析。
- 可视化单个受体颗粒在细胞表面的运动。
- 对膜域内受体组织的见解。
- 展示受体-受体的短暂相互作用。
结论
- 该方法增强了对活细胞中受体动力学的理解。
- 可以扩展到研究其他膜蛋白。
- 研究结果为更广泛的细胞生物学领域做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence microscopy enables direct visualization of receptor dynamics in living cells, providing critical insights into target behavior that are obscured in ensemble assays. This approach supports early-stage target validation by revealing receptor organization, complex formation, and transient interactions in native membrane environments. The resulting quantitative data enhances predictive confidence in lead identification and mechanistic de-risking for GPCR and other membrane protein targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing receptor monomers, dimers, and oligomers in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of receptor complex size and stoichiometry via mixed Gaussian fitting of intensity distributions.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by characterizing transient receptor-receptor interactions that underlie signaling mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates diffusion coefficients and mobility profiles that serve as functional biomarkers for receptor state.
- Operational Value: Delivers reproducible, single-particle tracking data suitable for assay standardization across compound screening campaigns.
- Scientific Value: Enables detection of ligand-induced changes in receptor dynamics, supporting phenotypic screening approaches.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by validating receptor behavior in disease-relevant cellular models.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized imaging and analysis workflows.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking receptor dynamics to downstream signaling outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, informing target validation prior to lead identification and enabling data-driven decisions in preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of receptor organization and interaction kinetics in native membranes.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative mobility and complex size readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Yields diffusion coefficients, complex size distributions, and interaction frequencies for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects single-molecule observations to cellular signaling continuity in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse membrane proteins across multiple cell lines and labeling strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in receptor signaling models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized sample preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement and complex formation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated dynamic behavior in living systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transfection, and single-molecule fluorescence microscopy.
- Depends on TIRF microscopy systems with high NA objectives, EMCCD cameras, and laser excitation sources.
- Necessitates cross-team standardization of labeling, imaging, and analysis parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for varying receptor expression levels, membrane environments, and fluorophore brightness.
- Includes practical limitations such as photobleaching, background fluorescence, and the need for low expression levels to ensure single-molecule sensitivity.
