Introduction
zebrafish (Danio rerio) व्यवहार 1 और चिकित्सा अनुसंधान 2,3 के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव है कि भारत में होने वाले एक छोटे teleost प्रजाति है. Zebrafish भी सामान्य व्यवहार पर उनके प्रभाव को चिह्नित करने के लिए आदेश में विभिन्न औषधीय पदार्थों के परीक्षण में उपयोग किया जाता है. विभिन्न खुराक एवं औषधि प्रशासन के कार्यक्रम में इस तरह के उत्तेजक 4, anxiolytics 5 और इथेनॉल 6-8 के रूप में यौगिकों के प्रशासन के बाद zebrafish के व्यवहार की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है.
हमारी प्रयोगशाला भी सामान्यतः scototaxic परख के रूप में भेजा अच्छी तरह से मान्य / प्रकाश अंधेरे परख 9, 20, में zebrafish चिंता और हरकत पर इथेनॉल प्रशासन के कार्यक्रम भिन्न के प्रभावों की जांच की है. इथेनॉल प्रशासन की एक नई पद्धति समय की एक लंबी अवधि (21 दिन) पर 6 दोहराव, दैनिक प्रशासन के लिए दक्षता बढ़ाने के लिए विकसित किया गया था 10-12 का उचित मिश्रण युक्त दूसरे के लिए एक टैंक से स्थानांतरित कर दिया. इस विधि व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है, वहीं zebrafish फंसाना शुरू करने और दवा समाधान से मछली निकालने के लिए लगने वाले समय में परिवर्तनशीलता वृद्धि हो सकती है. इसलिए, ब्याज की चक्रवृद्धि के लिए सही लोगों तक पहुंचाने के दोहराया खुराक से जुड़े एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर भिन्न हो सकते हैं. परिवहन के समय में परिवर्तनशीलता से stemming त्रुटि के स्रोतों को कम कर देता है कि एक विधि इस प्रकार वांछनीय है. हमारे विधि के साथ हम एक मछली में समान खुराक समय में जिसके परिणामस्वरूप, एक साथ सभी मछली ले जाने में सक्षम हैं. (यहाँ वर्णित) इथेनॉल जोखिम के बाद, zebrafish किसी भी कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा में परीक्षण किया जा सकता हैचिंता का आकलन है कि उन सहित व्यवहार assays, के आर. नई विधि का उपयोग कर मछली के समूहों dosing सही ढंग से दोहराने के लिए और मछली के समूहों के विषयों के बीच और भर खुराक मानकीकृत करने की क्षमता से परे व्यावहारिक उपयोग करता है. शोधकर्ताओं ने अपने प्रयोगों में replicability और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए हमारे तरीकों का उपयोग देख सकते हैं एक ही बार में कई मछली की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है कि नए सॉफ्टवेयर का आगमन. व्यवहार तंत्रिका विज्ञान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में zebrafish के व्यापक उपयोग को देखते हुए, इस विधि भविष्य औषधीय अध्ययन में दक्षता और व्यावहारिकता में वृद्धि होगी.
वर्तमान प्रतिमान में, एक दोहराया dosing अनुसूची लगभग मानव पीने कार्यक्रम दर्पण कि नियोजित किया गया था. नियंत्रण, दैनिक-मध्यम, या साप्ताहिक द्वि घातुमान: मछली बेतरतीब ढंग से तीन में से एक समूह को सौंपा गया. खुराक अनुसूची यह काफी पिछले अध्ययनों 7 में जोखिम बार पार हो गई क्योंकि चुना, अवधि में 21 दिन था. नियंत्रण मछली शून्य एल्को प्राप्तhol, दैनिक-उदारवादी मछली प्रति दिन एक बार 0.2% शराब प्राप्त किया, और साप्ताहिक द्वि घातुमान मछली प्रति सप्ताह 1.4% शराब एक बार प्राप्त किया. प्रकाश / अंधेरे कार्य वापसी के 2 दिन के बाद चिंता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह एक तरफ दीवारों सफेद कर रहे हैं और दूसरी तरफ 9 अंधेरे हैं, जिसमें एक आयताकार क्षेत्र का उपयोग करता है, जो प्रशासन के लिए एक अपेक्षाकृत सरल परीक्षण है. वयस्क zebrafish मजबूती नियंत्रण की स्थिति 6,9,13 के तहत क्षेत्र के अंधेरे पक्ष पसंद करते हैं. वृद्धि की चिंता सक्रिय अंधेरे क्षेत्र में खर्च काफी अधिक समय के रूप में परिभाषित है, और मछली प्रकाश क्षेत्र में खर्च अपेक्षाकृत अधिक समय खर्च करता है जब चिंता माना जा सकता है की कमी हुई है. गति ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के साथ, अन्य जानकारीपूर्ण चर भी औसत वेग, गतिहीनता, meandering सहित मात्रा निर्धारित है, और जोन 14 बदलाव किया जा सकता है.
हमारी प्रयोगशाला में विकसित की खुराक विधि पानी में घुलनशील यौगिकों एक या अधिक zebrafi को प्रशासित रहे हैं, जिसमें किसी भी अनुसंधान के लिए आवेदन कर सकते हैंश. इस पद्धति से लाभ हो सकता है, जो कई अन्य औषधीय एजेंटों वर्तमान zebrafish में परीक्षण किया जा रहा है. आमतौर पर परीक्षण किया यौगिकों इथेनॉल के लिए एक समान तरीके से भंग कर रहे हैं जो निकोटीन, च्लोर्दिअज़ेपोक्षिदे, buspirone, और scopolamine, शामिल हैं; पानी में रासायनिक की उचित मात्रा में मिश्रण से. इसलिए, इस प्रक्रिया के सामान्य गुंजाइश बहुत व्यापक और इथेनॉल तक ही सीमित नहीं है. इसके अलावा, कई दिनों के लिए दवाओं के साथ खुराक के बाद, प्रकाश / अंधेरे कार्य में नियोजित किया जा सकता है कि कई व्यवहार परीक्षण का एक ही है. ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन के बाद या वापसी के दौरान, उपयोग किया जा सकता है कि अन्य लोकप्रिय assays के उपन्यास टैंक डाइविंग परीक्षण 15 और ऐसे 16 shoaling के रूप में सामाजिक व्यवहार का परीक्षण शामिल हैं. निम्नलिखित प्रक्रिया को बार-बार ब्याज की एक औषधीय यौगिक युक्त समाधान में मछली या व्यक्ति मछली के समूहों में परिवर्तित करने का एक कारगर तरीका रूपरेखा तैयार करेंगे. इसके अतिरिक्त, प्रकाश / अंधेरे परीक्षण के साथ परीक्षण चिंता की प्रक्रियाशराब प्रशासन के लंबे कार्यक्रम के उजागर होने के बाद वापसी कर रहे हैं जो मछली के समूहों में वर्णित किया जाएगा.
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं और व्यवहार परीक्षण देखभाल और प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के लिए पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के लिए कनाडा परिषद के अनुपालन में है जो प्रोटोकॉल संख्या 06-11-12 के तहत MacEwan विश्वविद्यालय के पशु रिसर्च एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. Dosing टैंक, समाधान, और प्रशासन अनुसूची तैयार
- जानवरों के एक ही वातावरण में और दृश्य उत्तेजनाओं को समय या biasing के किसी भी घालमेल से बचने के लिए दिन के एक ही समय के दौरान dosed कर रहे हैं कि इस तरह के एक प्रशासन अनुसूची तैयार करें.
- समूह आकारों की संख्या के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में कई समान, 1.5 एल, स्पष्ट polypropylene के spawning के टैंक प्राप्त करते हैं. मछली के 2 समूहों के लिए अनुमति देता है जो टैंक प्रति 8 मछली, का प्रयोग समूहों प्रक्रिया में बाद में दिन प्रति परीक्षण किया जाना (चरण 3 देखें). एक जोत टैंक और समूह के प्रति एक खुराक टैंक (समूहों की 2x कुल संख्या) का उपयोग करें.
- सभी पकड़े टैंक में 400 माइक्रोन spawning के सम्मिलित रखें. एफबीमार वास पानी या सही तापमान पर असमस पानी रिवर्स साथ टैंक (zebrafish के लिए, 25-28 डिग्री सेल्सियस) तापमान मछली के साथ संगत है कि आम तौर पर रखे जाते हैं.
नोट: कुछ दवाओं और बफर वास पानी के रासायनिक घटकों के बीच अवांछित रासायनिक बातचीत हो सकती है. इस स्थिति में, रिवर्स औषधि प्रशासन के लिए कम से कम या कोई मछलीघर नमक के साथ बफर असमस पानी, साथ ही साथ के लिए नियंत्रण समूहों का उपयोग करें. - टैंक खुराक दौरान बाहरी दृश्य उत्तेजनाओं को कंडीशनिंग मछली से बचने के लिए एक तटस्थ वातावरण में कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
- सभी पकड़े टैंक में 400 माइक्रोन spawning के सम्मिलित रखें. एफबीमार वास पानी या सही तापमान पर असमस पानी रिवर्स साथ टैंक (zebrafish के लिए, 25-28 डिग्री सेल्सियस) तापमान मछली के साथ संगत है कि आम तौर पर रखे जाते हैं.
- दवा समाधान तैयार है. Spawning के टैंक में वास पानी के साथ दवा की उचित मात्रा में मिलाएं. पानी के 1497 मिलीलीटर के साथ एक उच्च ग्रेड इथेनॉल (95% गैर विकृत इथेनॉल) के 3 मिलीलीटर के संयोजन से 0.2% इथेनॉल समाधान तैयार है. पानी के 1479 मिलीलीटर के साथ इथेनॉल के 21 मिलीलीटर के संयोजन से 1.4% इथेनॉल समाधान तैयार है.
2. नेटिंग मछली और नैतिकताhanol प्रशासन प्रक्रिया
- ध्यान से शुद्ध उनके निवास टैंक से मछली और spawning डालने वाले उपयुक्त जोत टैंक में स्थानांतरण. आदर्श रूप में, पूरी तरह से जाल को खत्म करने के लिए spawning डालने में मछली हाउस.
- उनके संबंधित होल्डिंग टैंक में सभी मछली के साथ, धीरे spawning के जोत टैंक से बाहर डालने और उचित दवा समाधान टैंक (चित्रा 1 ए) में जगह उठा.
- के रूप में आवश्यक खुराक बार रिकॉर्ड. यहाँ वर्णित प्रक्रिया के लिए इथेनॉल समाधान में 30 मिनट का प्रयोग करें.
- यदि संभव हो तो, सहायकों सटीक खुराक समय सुनिश्चित करने के लिए एक साथ दवा समाधान करने के लिए सभी प्रयोगात्मक समूहों के हस्तांतरण के साथ मदद कर सकते है. वैकल्पिक रूप से, एक समय में एक समूह को हस्तांतरण और व्यक्ति समूहों 'खुराक टाइम्स (चित्रा 1 ए) का ट्रैक रखने.
- अपेक्षित खुराक की अवधि के अंत में, ध्यान से spawning डालने उठाने से इथेनॉल समाधान से मछली को दूरदवा समाधान की और धीरे वापस जोत टैंक में रखकर बाहर.
- होल्डिंग टैंक में मछली और अगले अनुसूचित खुराक समय तक वापस अपने निवास में उन्हें जगह, या spawning के जाल को खत्म करने के लिए वापस जोत टैंक में डालने के लिए जगह धीरे शुद्ध.
- पशु आवास के उपकरण, घर जोत टैंक के रूप में प्रयोग किया जाता है कि एक ही टैंक और spawning डालने में पशुओं के दायरे में पहले से, यदि संभव हो तो उल्लेख किया है. यह प्रशासन की प्रक्रिया के दौरान पूरी तरह से जाल को समाप्त होगा.
3. व्यवहार परीक्षण
- लंबे समय 55 सेमी और एक सफेद निविड़ अंधकार मंजिल (चित्रा 1 बी) के साथ गहरे 9.5 सेमी से 9.5 सेमी चौड़ा एक / प्रकाश अंधेरे क्षेत्र प्राप्त करते हैं. अखाड़ा सफेद में कवर किया और आधे काले रंग में कवर के आधे के साथ, वेल्क्रो का उपयोग क्षेत्र के अंदर दीवारों को सफेद और काले निविड़ अंधकार गैर चिंतनशील कागज प्रत्यय. 25-28 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर वास पानी के साथ 5 सेमी की गहराई तक क्षेत्र भरें. Maintपरीक्षण के दौरान इस तापमान ऐन.
- क्षेत्र में स्थित होने के लिए एक सफेद तीन तरफा बाड़े के निर्माण से बाहरी दृश्य उत्तेजनाओं minimalize. परीक्षण क्षेत्र पानी की सतह पर प्रतिबिंब का कारण नहीं है कि भूमि के ऊपर प्रकाश फैलाना है, अभी तक पर्याप्त रूप से आंदोलन ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर, या पद के लिए उज्ज्वल है सुनिश्चित करें वीडियो चित्र से -hoc पुस्तिका मात्रा का ठहराव.
- बाड़े में अखाड़ा प्लेस और व्यवहार ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की रिकॉर्डिंग और आंदोलन विश्लेषण मानकों सेट. अनुसंधान प्रश्न पर निर्भर करता है, 5-15 मिनट के लिए परीक्षण अवधि निर्धारित करें.
नोट: यहाँ, हम 5 मिनट के लिए इस्तेमाल किया. - मछली का समूह वास टैंक में अनुसंधान के क्षेत्र के लिए परीक्षण किया जाना परिवहन और क्षेत्र बाड़े के बाहर उन्हें जगह है. 10 मिनट के लिए मछली acclimate.
- प्रकाश / अंधेरे क्षेत्र के केंद्र में उपयुक्त समूह और जगह से धीरे शुद्ध एक मछली, यह avo करने के लिए क्षेत्र की लंबी अक्ष के समांतर स्थिति में है जब मछली को रिहा करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहाप्रकाश या अंधेरे क्षेत्र को मछली biasing आईडी.
- पशु जारी की है तुरंत बाद रिकॉर्डिंग व्यवहार शुरू करो. मछली ट्रैकिंग के साथ या मछली कूद या ठंड के लिए किसी भी सॉफ्टवेयर की समस्याओं के लिए देखो. विषयों का आधा कारण क्षेत्र के अंत बाड़े के खुले अंत की ओर उन्मुख है जो से उत्पन्न पूर्वाग्रहों को किसी भी घालमेल को रोकने के लिए परीक्षण किया गया है के बाद क्षेत्र में 180 डिग्री घुमाएँ.
- परीक्षण, धीरे शुद्ध समाप्त हो गया और एक जोत टैंक या वास की टंकी के लिए मैदान से मछली को दूर करने के बाद.
4. विश्लेषण
- अंधेरे क्षेत्रों बनाम प्रकाश में बिताए समय की जाँच करें. प्रत्येक समूह और प्रत्येक मछली के लिए, प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों में खर्च सापेक्ष समय प्राप्त है और एक एक नमूना टी -test का उपयोग विश्लेषण (या Wilcoxon nonparametric डेटा के लिए रैंक परीक्षण पर हस्ताक्षर किए, फर्क कुल परीक्षण समय के (आधा) 150 सेकंड से) समूहों में काफी दूसरे के ऊपर एक क्षेत्र को पसंद करते हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए.
- एक prefe गणना, वरीयताओं तुलना करने के लिएअंधेरे क्षेत्र में बिताए समय से प्रकाश क्षेत्र में बिताया और समूहों के बीच मतभेदों की तुलना समय को घटाकर की rence सूचकांक. टी परीक्षण दो समूहों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Tukey के एचएसडी पद हॉक परीक्षण के उपयोग के विचरण का एक तरह से विश्लेषण के साथ कई समूहों की तुलना करें, जहां आवश्यक (डन एकाधिक तुलना nonparametric डेटा के लिए पोस्ट अस्थायी परीक्षण के साथ या Kruskal वालिस परीक्षण).
- समूहों में वेग, घुमावदार क्षेत्र संक्रमण, की संख्या, और गतिहीनता की तुलना करें. Tukey के एचएसडी पद हॉक परीक्षण के उपयोग के विचरण का एक तरह से विश्लेषण का प्रयोग करें, जहां आवश्यक (डन एकाधिक तुलना nonparametric डेटा के लिए पोस्ट अस्थायी परीक्षण के साथ या Kruskal वालिस परीक्षण).
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Representative Results
ऊपर वर्णित के रूप में यह लगातार और सही समय के लिए इथेनॉल प्रशासन की अवधि महत्वपूर्ण है zebrafish साथ औषधीय अध्ययन में सटीकता और नियंत्रण बनाए रखने के लिए. हमारी प्रक्रिया खुराक प्रक्रिया की आसानी और throughput वृद्धि कर सकते हैं. एक साप्ताहिक द्वि घातुमान या दैनिक-उदारवादी या तो समय पर इथेनॉल के प्रशासन के नियंत्रण की तुलना में, प्रकाश / अंधेरे परीक्षण के साथ मापा बदल चिंता का स्तर, में हुई. दो दिनों पिछले खुराक के बाद जब जांच की, (कोई शराब प्राप्त है, लेकिन अभी भी dosing टैंक में ले जाया गया है) नियंत्रण समूह में zebrafish (अखाड़ा के अंधेरे पक्ष पर नियंत्रण मछली खर्च काफी अधिक समय के साथ व्यवहार की उम्मीद की पद्धति, प्रदर्शित अन्य अध्ययनों से 6,9,13 में अनुभवहीन zebrafish के समान 2A चित्रा). (चित्रा 2B उनके पिछले इथेनॉल प्रशासन के बाद दो दिनों का परीक्षण जब साप्ताहिक द्वि घातुमान समूह में मछली कार्य में प्रकाश या अंधेरे या तो जोनों के लिए कोई वरीयता दिखाया (चित्रा -2) के प्रकाश की ओर वरीय; नियंत्रण समूह के विपरीत. वरीयता सूचकांक नियंत्रण और दैनिक मध्यम समूहों (चित्रा 2 डी) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर संकेत दिया. वहाँ समूहों (तालिका 1) भर में कोई महत्वपूर्ण तैराकी गति में अंतर, या गतिहीनता थे, और इसलिए, इस आशय मछली में एक मोटर घाटे के कारण नहीं था.
चित्रा 1:. हस्तांतरण प्रक्रिया और / प्रकाश अंधेरे अखाड़ा ये तस्वीरें स्थानांतरण प्रक्रिया को वर्णन (ए) प्रथम, मछली स्थानांतरण टैंक (बाएं) में स्थित हैं.. इथेनॉल युक्त टैंक dosing इथेनॉल समाधान के लिए स्थानांतरण टैंक से मछली एवरेज (दाएं). (ईसा पूर्व) चित्र resea की आवश्यकता हैrcher स्थानांतरण टैंक के बाहर और इथेनॉल समाधान टैंक में spawning डालने लिफ्ट करने के लिए. (डी) / प्रकाश अंधेरे क्षेत्र गहरे 9.5 सेमी और लंबे समय तक 55 सेमी से 9.5 सेमी चौड़ा मापा सचित्र रूप में. व्हाइट फर्श एक प्रकाश और अंधेरे क्षेत्र बनाने, दूसरे आधे पर अखाड़ा (बाएं) और सफेद दीवारों के आधे पर काली दीवारों के साथ साथ प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2: प्रतिनिधि परिणाम और 2 दिन वापसी के बाद zebrafish के तीन समूहों पर इथेनॉल खुराक प्रक्रिया के trackplots. (ए) 5 मिनट / प्रकाश अंधेरे परीक्षण के दौरान एक भी नियंत्रण zebrafish आंदोलन पथ का एक प्रतिनिधि trackplot. नीचे मछली प्रत्येक पिक्सेल के प्रतिनिधित्व वाले स्थान में बिताए समय के आधार पर परीक्षण के दौरान zebrafish आंदोलन का एक रंग का प्रतिनिधित्व है जो एक हीटमैप, के रूप में प्रतिनिधित्व ही zebrafish trackplot है. (बी) एक repres5 मिनट / प्रकाश अंधेरे कार्य के दौरान साप्ताहिक द्वि घातुमान समूह से एक भी zebrafish के entative trackplot. नीचे ही zebrafish से हीटमैप है. (सी) 5 मिनट / प्रकाश अंधेरे परीक्षण के दौरान एक भी दैनिक-उदारवादी zebrafish आंदोलन का एक प्रतिनिधि trackplot. नीचे ही zebrafish से हीटमैप है. (डी) वरीयता सूचकांक अंधेरे क्षेत्र में बिताए समय से प्रकाश क्षेत्र में बिताए समय को घटाकर की सभी समूहों के लिए गणना की गई. ऋणात्मक संख्याओं अंधेरे क्षेत्र के लिए वरीयता का संकेत मिलता है. सकारात्मक संख्या प्रकाश क्षेत्र के लिए वरीयता का संकेत मिलता है. परिणामों को नियंत्रित और 2 दिन वापसी * पी <0.05 (एक तरह से एनोवा) में दैनिक-उदारवादी गुटों के बीच वरीयता में एक महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है. नियंत्रण समूह में अंधेरे के लिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता, पी <0.05 (0 से एक नमूना टी -test, अंतर), और दैनिक-उदारवादी समूह में प्रकाश के लिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता, पी <0.05 (एक नमूना भी है नोट <उन्हें> टी -test, 0 से अंतर). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| वेग | स्थिरता | |
| (सेमी / सेक) | (एसईसी) | |
| 2 दिन Wd | 2 दिन Wd | |
| नियंत्रण (एन = 13) | 9.1 ± 0.6 | 1.9 ± 0.6 |
| द्वि घातुमान (एन = 14) | 9.8 ± 0.5 | 0.8 ± 0.2 |
| क्रोनिक (एन = 15) | 10.3 ± 0.5 | 2.5 ± 1.0 |
तालिका 1: प्रकाश / अंधेरे परीक्षण के दौरान औसत वेग और गतिहीनता. औसत तैरना वेग (सेमी / सेक) और वापसी के 2 दिन बाद zebrafish के एक प्रतिनिधि समूह की गतिहीनता (एसईसी) (± SEM के मतलब है). यहाँ, वेग या गतिहीनता दोनों में कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया गया. Holcombe एट अल से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया., (2013).
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Discussion
Zebrafish में दवा प्रशासन से जुड़े पिछले अध्ययनों बस दवा समाधान 12,16 में अपने घर की टंकी से उन्हें परिवहन के लिए मछली जाल पर भरोसा किया है. नेटिंग हमेशा संगत नहीं है और अक्सर होने के कारण महत्वपूर्ण व्यक्ति परिवर्तनशीलता है जो zebrafish, के भागने प्रतिक्रिया के लिए अपेक्षा से अधिक समय लेता है. पारंपरिक हस्तांतरण के तरीकों, उपयोगी है, जबकि मछली पानी के बाहर खर्च कुल समय की मात्रा कम है, साथ ही पशुओं के बीच हस्तांतरण के समय में परिवर्तनशीलता की मात्रा कम से पर सुधार किया जा सकता है. व्यावहारिकता में सुधार के अलावा, इस विधि शोधकर्ताओं ने एक साथ समय की एक सटीक राशि के लिए एक समाधान में मछली के बड़े समूहों खुराक की क्षमता देता है. पिछला तरीकों या तो एक भी मछली खुराक, या एक साथ मछली के समूहों पूरे शुद्ध करने के लिए प्रयास की आवश्यकता होती है. बाद के एक अजीब और मुश्किल काम है, जबकि पूर्व, धीमी है और throughput कम हो जाती है. इसके अलावा, गति ट्रैकिंग प्रणाली है कि गएक इस विधि की शुद्धता से फायदा हो सकता है एक ही बार में कई मछली के व्यवहार का आकलन करें. मछली सभी मछली के लिए क्षेत्र के लिए एक साथ जोखिम के पास यह सुनिश्चित करना होगा जो shoaling के मैदान में spawning के डालने से सीधे हस्तांतरित किया जा सकता है.
एक 21 दिन की अवधि में zebrafish के तीन समूहों पर लागू जब इस नई विधि का उपयोग महत्वपूर्ण परिणाम का उत्पादन किया. नियंत्रण मछली कोई शराब, दैनिक-उदारवादी मछली प्रति दिन एक बार शराब की एक छोटी राशि प्राप्त प्राप्त किया, और साप्ताहिक द्वि घातुमान मछली 21 दिन की अवधि में प्रति सप्ताह एक बार शराब की एक बड़ी मात्रा प्राप्त किया. प्रकाश / अंधेरे कार्य में खुराक प्रक्रिया नियंत्रण परिस्थितियों में अंधेरे क्षेत्र के लिए zebrafish के सामान्य वरीयता बदलाव नहीं किया. हालांकि, इथेनॉल वापसी के 2 दिन बाद, दैनिक-उदारवादी समूह में zebrafish क्षेत्र के प्रकाश क्षेत्र, वरीयता के एक उलट प्राथमिकता दी. सांख्यिकीय विश्लेषण क्षेत्र वरीयता में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन की पुष्टि करता है. यह संभव है कि खुराक proceduकारण उज्ज्वल खुराक क्षेत्र के लिए उसके रिश्तेदार समानता के कारण मछली की मांग इथेनॉल (एक भूख बढ़ाने वाला प्रोत्साहन), और सफेद क्षेत्र को प्राथमिकता के साथ एक वातानुकूलित जगह वरीयता (सीपीपी) के व्यवहार की मांग इथेनॉल के परिणामस्वरूप कर रहे हैं. हाल के शोध zebrafish इथेनॉल 17,18 के साथ dosed रहे हैं जहां सीपीपी zebrafish में और क्षेत्रों में हो सकता है कि पता चलता है. साप्ताहिक द्वि घातुमान-मछली 2 दिन इथेनॉल पोस्ट कोई वरीयता दिखाया है, और इस खोज के लिए लेखांकन तंत्रिका तंत्र के बारे में सबूत की कमी है, हालांकि, यह शराब का निराला लेकिन बड़ी खुराक संभवतः क्षेत्रों के बीच भेदभाव करने में असमर्थ मछली छोड़ने, मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है कि संभव है.
इस खुराक प्रक्रिया शोधकर्ताओं पर प्रदान कि एक और लाभ यह अपने generalizability है. बताया गया है, प्रक्रिया zebrafish में स्पष्ट और उपयोगी परिणाम लाता है. हालांकि, प्रक्रिया पूरी तरह zebrafish तक सीमित नहीं है. प्रक्रिया पर बाधाओं आकार और dosing टैंक, जानवरों और testi की सीमा से संबंधित हैंएनजी उपकरण, साथ ही डेटा का विश्लेषण करने की क्षमता. गति ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ, हाल के अध्ययनों से एक परीक्षण के दौरान कई अतिरिक्त चर की जांच की है. सफेद सफेद क्षेत्र को विलंबता परिहार आदी होना, पार कर चौराहों, हरकत आदी होना, अनियमित तैराकी, thigmotaxis (अखाड़ा दीवारों के पास बिताए समय), और जोखिम मूल्यांकन भी 14 मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. यह सहिष्णुता और वापसी 19 की भूमिका की जांच के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है जो इस तरह के सुनहरी रूप में अन्य मॉडल जीवों, में इस प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए बोधगम्य है. अन्य औषधीय एजेंटों या पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के प्रभाव की जांच करने के लिए उम्मीद कर रहा शोधकर्ताओं, अन्य व्यवहार assays, या अन्य समुद्री या ताजे पानी पशुओं के उपयोग, भी इस बुनियादी पद्धति का उपयोग कर सकता है.
इस प्रोटोकॉल का प्रयोग सरल और प्रभावी है. परिणामों की उम्मीद नहीं कर रहे हैं हालांकि, अगर उचित डेटा संग्रह सुनिश्चित करने के लिए गति ट्रैकिंग प्रणाली के निवारण पर विचार करें. Trackinजी परीक्षण के पार चिकनी और सटीक होना चाहिए. ट्रैकिंग प्रणाली को हर समय मछली के शरीर-केंद्र के आंदोलन रिकॉर्डिंग की जानी चाहिए. ट्रैकिंग का कोई भी कूदते या अनियमित आंदोलन की वजह से इस तरह के पानी की लहर पर प्रकाश प्रतिबिंब, या परिणाम उलझाना सकता अनुचित ट्रैकिंग सेटिंग्स के रूप में दृश्य कलाकृतियों, को डॉट. परिणामों में कुछ विसंगतियों क्षेत्र डिजाइन या खुराक वातावरण में छोटे मतभेदों से उत्पन्न हो सकती है. प्रतिकृति के बारे में सुनिश्चित होने के लिए क्षेत्र के रूप में zebrafish में ट्रैकिंग क्षमता को अधिकतम करने के लिए एक सफेद मंजिल का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से सम्मान के साथ वर्णित किया जाना चाहिए. रंग में हल्का कर रहे हैं कि अन्य मछली के साथ, एक अंधेरे मंजिल प्रस्ताव पर नज़र रखने में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसी तरह, मछली पूर्वाग्रह संभवतः सकता है कि किसी भी दृश्य उत्तेजनाओं से मुक्त है कि एक वातावरण में मछली dosing अत्यंत महत्वपूर्ण है. मछली को समझ योग्य है कि किसी भी अलग रंग, पैटर्न या रंग परिणाम उलझाना सकता है. आवास प्रणाली में है कि इसी तरह एक तटस्थ, हल्के रंग की पृष्ठभूमि की सिफारिश की है. </ P>
यह मछली की अन्य प्रजातियों के लिए आवश्यक के रूप में इस पद्धति को संशोधित करने के लिए संभव है, परिणाम जन्मजात / प्रकाश अंधेरे वरीयता 20-21 के मामले में भिन्न हो सकते हैं. यह अभी भी कुछ तनाव का कारण बनता है भी यहां वर्णित प्रक्रिया नोट करना महत्वपूर्ण है. जाल काफी कम है, प्रक्रिया अभी भी मछली संभवतः एक तनाव प्रतिक्रिया उत्प्रेरण, पानी से बाहर किया जाना चाहिए, जहां समय की एक बहुत ही कम अवधि शामिल है. रामसे और उनके सहयोगियों ने 22 netted zebrafish गोल नहीं कर रहे थे कि उन लोगों की तुलना में उनके शरीर में कोर्टिसोल के कम से कम दो स्तरों पड़ा मिला. कोर्टिसोल तनाव 11 से जुड़ा हुआ एक हार्मोन है के बाद से यह मापा जाता है कि व्यवहार की प्रतिक्रिया को बदल सकता है. हमारे विधि जाल को कम कर देता है, यह यह खत्म नहीं करता. हालांकि, यह शोधकर्ताओं वे spawning के सम्मिलित में आवास zebrafish द्वारा इच्छा जाल की घटनाओं को खत्म करने का अवसर देता है. भविष्य के अध्ययन की जांच करनी चाहिए कि क्या spawning के inser का उपयोगमछली के हस्तांतरण के लिए टी जाल को तनाव प्रतिक्रिया सापेक्ष कम कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, यह सटीक खुराक समय को बनाए रखने और समूहों के बीच कई बार स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण है. समय में कई बार या बड़े मतभेद dosing में परिवर्तन के परिणाम बदल सकता है पानी से बाहर बिताया. संभव circadian प्रभाव को कम करने के लिए, यह भी दिन की इसी समय के दौरान मछली खुराक के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान प्रयोग मछली में dosed गया और 10:00-14:00 परीक्षण किया. इस प्रक्रिया के सही और विश्वसनीय प्रतिकृति परिशुद्धता के साथ प्रोटोकॉल दोहरा पर निर्भर करता है.
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Disclosures
लेखकों चित्रा 1 के लिए इस्तेमाल किया उसकी फोटोग्राफी उपकरणों के उपयोग के लिए यहोशू गैलप स्वीकार करते हैं. यह काम (TJH करने के लिए) एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) कनाडा डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
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